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Speedy A蛋白调控相关miRNA的筛选及miR-23b靶标的验证
目的 筛选和鉴定调控Speedy A蛋白表达的miRNAs. 方法 通过在线数据库TargetScan、miRNA和miR-walk预测与Speedy A相互作用的miRNAs,并结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库,筛选出评分较高的候选miRNAs.实时定量PCR检测小鼠7、14、21、35、64 d睾丸中候选miRNAs和Speedy A基因的表达,筛选出表达趋势呈显著负相关的miRNAs.构建野生型Speedy A基因3’端非翻译区荧光素酶报告基因载体(WT-Speedy A-3,UTR)及miR-23b靶序列突变型载体(mut-Speedy A-3'UTR),分四组转染HEK-293T细胞株:野生型实验组,WT-Speedy A-3,UTR质粒+miR-23b mimic;野生型对照组,WT-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic NC;突变型实验组,mut-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic;突变型对照组:mut-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic NC,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性. 结果 通过生物信息学方法结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库筛选出4个评分较高的miRNA:miR-23b、miR-143、miR-345-3p和miR-881.实时荧光定量PCR检测不同发育时期小鼠睾丸中以上4种miRNAs和Speedy A基因的表达水平,结果显示在不同发育时期的小鼠睾丸中,miR-23b的表达趋势与Speedy A呈显著负相关(P＜0.01).成功构建了重组野生型/突变型(WT/mut) Speedy A3’-UTR载体,通过双荧光素酶报告基因检测显示野生型实验组相比对照组吸光值明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 野生型实验组对其它3组对照组荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-23b能够靶向调控Speedy A基因的表达.
