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小RNA病毒3'非编码区结构与功能的研究进展
小RNA病毒基因组的两侧分别为5'非编码区(UTR)和3'UTR.研究表明:5'/3' UTR能形成复杂的RNA结构,如颈-环结构、三叶草结构和假结体结构等,在病毒的复制或翻译过程中发挥重要调节作用.本文即对近10年来有关小RNA病毒3'UTR的结构与功能研究方面的进展情况进行综述.
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肠道病毒71型非编码区结构与功能研究进展
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是婴幼儿手足口病的重要病原体之一,也是继脊髓灰质炎病毒之后的又一种非常重要且常见的嗜神经病毒.EV71非编码区(untranslated regions,UTRs)的某些位点突变或空间结构改变会影响病毒翻译和复制能力以及病毒对细胞组织的亲和力,甚至导致毒力发生变化.目前,EV71的致病机制尚不明确,非编码区的研究是必不可少的一部分,本文综述了近几年来关于EV71非编码区基本结构以及功能研究的新进展.
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慢性HCV感染者中分离的不同长度3'UTR-PolyU/UC段对IRES介导的翻译及NS5B合成RNA影响
目的研究丙型肝炎病毒3'非编码区(3'UTR)及不同长度PolyU/UC段对内在核糖体进入位点(IRES)介导翻译的影响以及对NS5B聚合酶合成RNA的影响.方法通过构建含有HCV IRES、荧光素酶(firefly luciferase)报道基因和内含不同长度PolyU/UC区的3'UTR序列的系列重组质粒,采用体外翻译和细胞转染等方法检测报道基因表达的水平.结果体外翻译实验和细胞转染实验显示3'UTR对IRES介导的翻译具有增强作用,在体外翻译体系中这种增强作用与PolyU/UC区的长度相关,而在细胞中则与PolyU/UC区的长度无明显相关性;3'UTR对共转染的重组NS5B质粒的复制活性具有抑制作用,这种抑制作用也与PolyU/UC区长度不成正比.结论 HCV 3'UTR与蛋白翻译及RNA合成有关,在细胞中并不与PolyU/UC区的长度相关.
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HIV-1辅助受体CXCR4配体暨趋化因子SDF-1α转录子基因多态性研究
目的 研究趋化因子SDF-1α转录子基因突变,分析突变发生频率,以及其对HIV感染的影响.方法 研究对象包括居住在中国香港地区的278名HIV阴性健康中国人,49例HIV阳性白种人和13名高危未感染中国人.分别提取外周血单个核细胞基因组DNA和总RNA.建立PCR及逆转录PCR法,对SDF-1α启动子(promoter)、开放读码区(ORF)和3'端非编码区(3'UTR)基因进行序列分析.用人工引入点突变的错配引物双重PCR法对一新发现突变进行筛查,分析其在研究对象中的分布及意义.结果 对包括13名高危中国人、49例白种人和38名随机选取的健康中国人在内的100份标本测序分析显示,在SDF-1α启动子及ORF区内未见任何突变;在SDF-1α3'UTR发现一"GA"插入式基因突变,命名为SDF-1-3'GA(+),在GenBank中的序列号为AY874118.该突变在3组研究对象中均有发生,在健康中国人中的频率为15.1%(84/556),但在13名有HIV接触而未感染的高危人群中发生频率为30.7%(8/26).结论 与本身重要生理功能相对应,SDF-1α基因十分保守;在其3'UTR新发现突变SDF-1-3'GA(+)是否影响HIV感染,值得进一步研究.
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hsa-miR-655靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的实验研究
目的 研究靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNAs.方法 通过生物信息学预测可能与CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)作用的miRNAs;将人工合成的野生型和突变型CLCF1基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒;将重组荧光素酶报告载体和miRNAs表达载体共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证miRNA对CLCF1基因翻译水平的抑制作用.结果 生物信息学预测结果显示,CLCF1基因3'UTR与hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515等5个miRNAs存在互补结合位点;双荧光素酶实验结果表明,与对照组比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09％,差异有显著性意义(P=0.001),当使用突变型CLCF1基因3 'UTR,荧光活性上调至67.22％,说明hsa-miR-655对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用;与对照组比较,hsa-miR-374c和hsa-miR-515组荧光活性分别下调27.27％ (P=0.000)和27.74％(P=0.006),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有一定抑制作用;hsa-miR-300和hsa-miR-381组与对照组相比,荧光活性分别下调6.35％ (P =0.213)和9.89％ (P =0.127),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达无明显抑制作用.结论 hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的表达.
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大鼠Prestin-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定
目的 构建大鼠Prestin基因(SLC26A5)3'端UTR区双荧光素酶报告系统,为研究Prestin基因的microRNA调控提供基础平台.方法 以C6细胞基因组DNA为模板PCR扩增SLC26A5基因的3'UTR序列,并连接至pmri-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体多克隆位点,测序验证插入序列并转染入293T细胞检测其荧光素酶活性.结果 测序结果表明PMIR-3'UTR的插入序列正确,在转染入293T细胞后其荧光素酶能正常表达.结论 大鼠Prestin-3' UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功.
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NOTCH1基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定
目的:构建含NOTCH1基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体,并验证其活性.方法:使用PCR方法扩增含NOTCH1基因3'-UTR区序列,插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中；使用生物信息学方法预测可能与NOTCH1基因3'-UTR相互作用的miRNA；使用lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒或空质粒和miR-34a inhibitor或control真核表达载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果:得到含NOTCH1基因3'-UTR(1 648 bp)序列的双荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证.NOTCH1基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点；用重组质粒和miR-34a inhibitor共转染的HEK293T组的荧光素酶活性比空质粒组高45％.结论:含NOTCH1基因3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功,miR-34a对NOTCH1基因有调控作用.
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SOX6基因3'UTR区野生型和突变型重组质粒的构建与鉴定
目的:构建含单核苷酸多态性(SNP)位点rs1065024的SOX6基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体,并用生物信息学软件预测与rs1065024位点区域相结合的miRNA,为进一步研究此SNP位点的功能及miRNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系奠定基础.方法:提取人全血基因组DNA,以基因组DNA为模板,通过PCR扩增含SNP位点在内的SOX6基因3’UTR片段,经过胶回收纯化后,将回收的目的片段插入双荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT中,再经DH5a转化扩增,挑单克隆进行菌落PCR并进行质粒提取,对质粒进行双酶切鉴定,后进行DNA测序鉴定.针对SNP进行定点突变,构建出野生型和突变型重组质粒,并用生物信息学软件预测出与SNP位点相结合的miRNA.结果:经单菌落质粒测序验证显示带有T碱基的SOX6基因3’UTR重组质粒pMIR-REPORT-3'UTR-T构建成功;经定点突变,成功将pMIR-REPORT-3'UTR-T质粒转变为pMIR-REPORT-3'UTR-C,经比对未引入任何其他突变;生物信息学预测显示,rs1065024位点位于miR-190b、miR-190a-5p、miR-451b、miR-4791与SOX6基因3'UTR的结合区域,其多态的改变可以影响miRNA与mRNA的结合效率.结论:本研究成功构建了含SNP位点rs1065024的pMIR-REPORT-SOX6-3'UTR野生型和突变型重组质粒,为今后SOX6基因3'UTR的SNP位点的功能及miRNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系研究奠定基础.
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中国大陆新发现丙型肝炎病毒3'非编码区终止密码子变异
目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3'非编码区(3'UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础.方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400bp的cDNA片段,克隆测序.结果获得的全长1b型HCV 3'端序列,由高变区、Poly(u)区、Poly(u/c)区及98碱基区4部分组成;首次发现终止密码子突变由TGA突变为TGG,可导致NS5B的翻译不能及时终止.结论半套式RT-PCR法可有效获得病毒基因组的全长末端序列;首次报道终止密码子突变导致NS5B区延长,3'UTR缩短.该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义.
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圆锥动脉干畸形患儿NOTCH1和JAG1基因3'非编码区变异分析
目的 · 探索NOTCH1和JAG1的3'非编码区(3'UTR)核苷酸变异与心脏圆锥动脉干畸形(CTD)的相关性.方法 · 采用病例-对照的研究方法,收集600名无22q11缺失的CTD患儿以及300名正常对照儿童.应用高通量测序技术直接检测样本人群NOTCH1和JAG13'UTR区段的序列,筛选变异位点,通过PCR和Sanger测序法验证变异的准确性.运用在线软件TargetScan、PicTar和microRNA.org对变异位点进行功能预测分析.结果 · 检测出CTD患儿NOTCH13'UTR区存在1个新发突变和3个单核苷酸多态性(SNP),JAG13'UTR区存在3个新发突变和6个SNP位点.其中JAG13'UTR区有2个SNP位点(rs3840074、rs8708)的基因型在病例组和对照组间的分布差异有统计学意义(均P<0.05).预测结果显示4个突变位点及2个有差异的SNP位点均可与微小RNA结合.结论 ·NOTCH1和JAG13'UTR区的核苷酸变异可能与心脏圆锥动脉干畸形的发生相关.
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Bcl-6基因3'UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-346靶向关系的验证
目的:构建Bcl-6基因3'非编码区(3'untranslated region,3'UTR)荧光素酶报告质粒,分析miR-346对Bcl-6的调控作用.方法:通过PicTar数据库和miRanda数据库预测可能与Bcl-6基因3'UTR作用的miRNA;将人工合成的Bcl-6基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒psiCHECK-2;将重组荧光素酶报告质粒和miRNA mimics共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果:PicTar数据库和miRanda数据库预测交叉结果显示,miR-346与Bcl-6基因3'UTR存在互补结合位点;构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确;重组质粒和miR-346 mimics共转染293T细胞后,荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性降低66％左右.结论:成功构建了Bcl-6基因3'UTR荧光素酶报告质粒,筛选出和Bcl-6表达相关的miRNA即miR-346.
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小鼠骨硬化蛋白的转录后调控机制
目的 构建含有小鼠骨硬化蛋白(Sost)基因3'非编码区(UTR)的荧光素酶报告基因载体(pMIR-REPORT-SOST UTR),利用原代培养的小鼠颅骨成骨细胞及MC3T3-E1小鼠前成骨细胞系,探究在成骨分化过程中Sost基因表达所受到的转录后调控作用.方法 成骨诱导C57 BL/6小鼠原代颅骨成骨细胞及MC3T3-E1细胞,分别检测各细胞中Sost基因mRNA和蛋白的相对表达水平.采用PCR克隆Sost基因3'UTR区,连接到荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT上,命名构建重组载体为pMIR-REPORT-SOST UTR.将pMIR-REPORT-SOST UTR和pMIR-REPORT转染至颅骨成骨细胞、MC3T3-E1细胞及NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞中,根据转染质粒将细胞分为pMIR-REPORT-SOST UTR组和pMIR-REPORT组,检测各组细胞中荧光素酶的相对表达水平.结果 成骨诱导小鼠颅骨成骨细胞及MC3T3-E1细胞Sost的mRNA水平较对照组均明显升高(P＜0.05),而Sost的蛋白水平与对照组相比变化不大(P＞0.05).在小鼠颅骨成骨细胞及MC3T3-E1细胞中,pMIR-REPORT-SOST UTR转染组较pMIR-REPORT转染组的荧光素酶相对表达水平均有所下降(P＜0.05),而在NIH3T3细胞中pMIR-RE-PORT转染组和pMIR-REPORT-SOST UTR转染组的荧光素酶相对表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了pMIR-REPORT-SOST UTR,且Sost基因的3'UTR区参与了具有细胞特异性的转录后调控.
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HIF-1α基因3'非编码区多态性与胰腺癌发生发展的相关研究
目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因3'非编码区多态性与胰腺癌发生、发展的关系.方法 以病例对照研究方法,采用聚合酶链扩增(PCR)和DNA序列测定分析技术,对291例胰腺癌患者(病例组)和247例健康对照者(对照组)的HIF-1α基因多态性位点进行特异扩增检测,分析HIF-1α3'非编码区SNP位点rs2057482基因型分布与胰腺癌发病风险的关系和对胰腺癌患者临床病理特征的影响.结果 HIF-1α基因rs2057482位点C/C基因型在病例组和对照组的频率分别为73.5％和61.9％,rs2057482位点C/T+ T/T在病例组和对照组的频率分别为26.5％和38.1％,两者差异有统计学意义(P＜0.01).携带C/C基因型者患胰腺导管腺癌的危险性是携带纯合C/T+ T/T基因型者的1.684倍(95％ CI:1.242 ～2.314).通过Logistic回归分析,胰腺癌中C/C基因型患者生存时间为(14.0±2.1)个月,低于C/T+ T/T基因型患者的(25.2±6.3)个月(P=0.01),且该位点在是否淋巴结转移者间基因型分布差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HIF-1 α基因3'非编码区rs2057482位点的单核苷酸多态性在胰腺癌发生、发展过程中发挥作用.
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江苏地区汉族人群HLA-G3'非翻译区基因多态性和单体型分析
目的 调查江苏地区合格献血者HLA-G 3'非编码区(3’-UTR)基因多态性和单体型特征.方法 提取江苏地区合格献血者全血基因组DNA,PCR方法扩增HLA-G 3'UTR,利用基因测序对多态性位点进行基因分型,直接计算基因频率和基因型频率,利用SHEsis软件分析单体型.结果 江苏地区88名献血者HLA-G 3'UTR共有8个多态性位点:+2960 14 bp插入/缺失,+3003C/T,+3010C/G,+ 3027A/C,+3035C/T,+3142C/G,+3187A/G,+3196C/G,其基因频率及基因型频率均符合Hardy-weinberg平衡定律(P＞0.05);各位点紧密连锁(D’＞0.7),SHEsis软件分析求得频率＞0.03的单体型有6种,其中单体型UTR-3(DTCCCG AC,频率=0.256)为常见.结论 本研究分析了江苏地区合格献血者HLA-G 3'UTR的8个多态性位点、连锁不平衡和单体型频率的特征,对于研究本地区HLA-G的基因多态性以及与相关疾病的关系提供了重要依据.
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PrLZ基因3'-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测
目的 分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3'非编码区(3' UTR)可能的微小RNA (miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具.方法 使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3'-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3'-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3'-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称NC)和过表达miR-34a(质粒名称miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293 T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3'-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性.结果 得到含PrLZ基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性.在miR 34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40％,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建PrLZ基因3'-UTR荧光素酶报告载体,miR 34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点.
