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HIV-1感染诱导丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Citron kinase上调机制研究
HIV-1感染可以改变宿主细胞的表达谱,上调和病毒转录复制翻译包装所需的宿主蛋白,使宿主变成更加适应病毒复制繁殖的环境.研究表明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Citron kinase(citK)可以促进HIV 1病毒的包装释放,所以我们在本文中进一步探讨了HIV-1感染对Citron kinase在自然生理状态下的表达是否有调节作用.我们用含有荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒感染外周血单个核细胞(PBMC)和HEK293T细胞系,检测Citron kinase表达的上调情况.此外,将Citron kinase的上游启动子克隆入含荧光素酶报告基因的载体上,检测HIV假病毒感染对Citron kinase启动子的影响.结果显示:HIV-1可以显著提高PBMC细胞中Citron kinase的表达量,而Citron kinase为HIV-1复制包装所需.在原代CD4+T细胞中过表达Citron kinase,HIV-1的复制可以提高2倍以上.沉默Citron kinase的表达,HIV-1病毒产生量显著降低.在HEK293T细胞系中,HIV-1假病毒感染可以使Citron kinase的mRNA的水平提高2.5倍,蛋白表达量提高2.7倍.我们通过将Citron kinase的启动子克隆到含有荧光素酶报告系统的载体上,感染HIV-1假病毒,发现荧光素酶的活性增加.这提示着HIV-1感染通过转录水平上调Citron kinase的表达,从而为病毒创造复制繁殖更有利的宿主环境.
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hsa-miR-655靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的实验研究
目的 研究靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNAs.方法 通过生物信息学预测可能与CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)作用的miRNAs;将人工合成的野生型和突变型CLCF1基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒;将重组荧光素酶报告载体和miRNAs表达载体共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证miRNA对CLCF1基因翻译水平的抑制作用.结果 生物信息学预测结果显示,CLCF1基因3'UTR与hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515等5个miRNAs存在互补结合位点;双荧光素酶实验结果表明,与对照组比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09％,差异有显著性意义(P=0.001),当使用突变型CLCF1基因3 'UTR,荧光活性上调至67.22％,说明hsa-miR-655对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用;与对照组比较,hsa-miR-374c和hsa-miR-515组荧光活性分别下调27.27％ (P=0.000)和27.74％(P=0.006),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有一定抑制作用;hsa-miR-300和hsa-miR-381组与对照组相比,荧光活性分别下调6.35％ (P =0.213)和9.89％ (P =0.127),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达无明显抑制作用.结论 hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的表达.
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聚肌苷酸胞苷酸在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活干扰素β荧光素酶报告基因系统实验条件的优化
目的 优化不同长度聚肌苷酸胞苷酸[polyinosinic acid:polycytidylic acid,poly(I∶C)]在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活I型干扰素(IFNβ)荧光素酶报告基因系统的实验条件.方法 将质粒IFN-β-1uc分别转染HEK293T及BEAS-2B细胞后,HEK293T细胞转染不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5和2.0μg/孔)的高分子量(HMW)poly(I∶C)和低分子量(LMW)poly(I∶C),检测其对HEK293T细胞中IFNβ启动子激活的影响;BEAS-2B细胞直接加入不同浓度(0.1、1.0、10.0、20.0和50.0μg/孔)及转染不同浓度(同HEK293T细胞)的HMW poly(I∶C)和LMWpoly(I∶C),检测其对BEAS-2B细胞中IFNβ启动子激活的影响.结果 poly(I∶C)转染HEK293T细胞激活IFNβ启动子的佳实验条件为:0.5 μg/孔的HMW poly(I:C)和LMW poly(I∶C)转染24 h.poly(I∶C)直接加入BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的佳实验条件为:50 μg/孔的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C)作用6h;poly(I∶C)转染BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的佳实验条件为:0.25 μg/孔的HMW poly(I∶C)转染12 h,0.5μg/孔的LMW poly(I∶C)转染12h.结论 成功优化了poly(I∶C)在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活IFNβ启动子的实验条件,为poly(I∶C)激活免疫反应机制的研究提供了实验依据.
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人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定
目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础.方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-1uc.荧光素酶分析检测启动子的活性.结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性.结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础.
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非诺贝特调控SOD1表达的机制
目的 研究非诺贝特调节SOD1表达的机制.方法 脑微血管内皮细胞和C57BL/6小鼠经非诺贝特处理后,实时荧光定量 PCR 检测 PPARα和 SOD1的表达;然后构建含 SOD1基因启动子序列或含SOD1基因启动子中PPRE结合区域突变后的荧光素酶报告质粒,转染脑微血管内皮细胞后检测荧光素酶活性.结果 在非诺贝特处理的脑微血管内皮细胞和C57BL/6小鼠,其PPARα和SOD1的表达升高,经非诺贝特处理后荧光素酶活性增强,由SOD1基因启动子PPRE结合序列突变后,即使非诺贝特处理,其荧光素酶活性未见改变.结论 非诺贝特通过激活PPARα以调节SOD1的表达.
关键词： 非诺贝特 超氧化物歧化酶 过氧化物酶体增生物激活受体 荧光素酶报告系统 -
基于分泌型荧光素酶亚细胞定位炎症小体活性报告系统的构建
目的 构建快捷、灵敏的亚细胞定位炎症小体活性报告系统,探讨各细胞器在炎症小体激活过程中的作用.方法 构建线粒体定位蛋白TOM20或内质网定位蛋白EMC3与白细胞介素-1β前体-分泌型荧光素酶的融合蛋白表达质粒,免疫印迹确认表达和免疫荧光染色确认亚细胞定位后,在Caspase-1和不同炎症反应刺激条件下,应用该报告系统检测炎症小体的活化情况.结果 建立的炎症小体报告系统分别定位于线粒体和内质网,可快速检测线粒体和内质网相关的炎症小体活性.结论 细胞器定位炎症小体活性荧光素酶报告系统能简便、快速地检测不同细胞器特异的炎症小体活性,可应用于无损伤的连续观察、动物活体研究和高通量药物筛选.
