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基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除
目的 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除.方法 设计靶向人DMD基因exon515′端及3′端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况.结果 50%的HEK293T细胞中DMD基因 exon51被定向切除,编辑效率较高.结论 建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因 exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础.
关键词： CRISPR/Cas9 DMD基因 单载体质粒 HEK293T细胞 外显子敲除 -
TRIM22稳定过表达细胞系的构建及其抗流感病毒的功能
目的 构建稳定表达TRIM22的HEK293T细胞系HEK293T-TRIM22,观察TRIM22蛋白在该细胞内的表达及对流感病毒复制的影响并初步探究其抑制机制.方法 扩增TRIM22基因并与反转录病毒载体进行体外重组连接,经菌液PCR、测序确认后与反转录病毒骨架载体共转染进HEK293T细胞进行包装病毒.用包装的反转录病毒感染HEK293T细胞,感染24 h后用嘌呤霉素筛选稳定过表达TRIM22的细胞,筛选48 h后用Western blot检测TRIM22表达水平;用IAV-LUC病毒检测稳定过表达TRIM22的HEK293T对流感病毒的抑制作用;再用双分子荧光互补实验(BiLC)检测与TRIM22相互作用的流感蛋白.结果 经测序确认目的基因TRIM22成功克隆到载体pQC-XIP中.包装反转录病毒并感染HEK293T细胞,经过嘌呤霉素筛选后,稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞中TRIM22的蛋白表达水平升高(P＜0.05).在稳定过表达TRIM22的细胞内流感病毒复制减弱(P＜0.05).BiLC检测TRIM22与流感蛋白NP有相互作用.结论 稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞系构建成功,TRIM22与NP有相互作用并且抑制流感病毒复制.
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人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达
目的 建立一个有效表达CD23的系统.方法 采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23 cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1B上,构建成pcDNA3.1/CD23 质粒表达载体;将pcDNA3.1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Western blot检测CD23在细胞中的表达情况.结果 扩增的CD23 cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23 cDNA在293T细胞膜上的表达.转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达.结论 扩增CD23 cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达.
关键词： CD23 HEK293T细胞 表达 Western blot 流式细胞分析 -
人血小板CD36转染细胞的建立及在CD36抗体检测中的应用
目的：通过TA克隆和细胞转染技术建立稳定表达人CD36的转染细胞,并应用于CD36抗体检测。方法提取人血小板总RNA,逆转录为cDNA,经PCR扩增获得人血小板的CD36基因片段；TA克隆后转化TOP10 E. coli,蓝白斑筛选获得阳性重组子pcDNA3.1/V5-CD36,提取质粒DNA进行序列测定；将序列一致的质粒DNA在Effectene(Invitrogen)作用下转染HEK293T细胞；通过流式细胞仪分选建立稳定表达人血小板CD36的转染细胞,并利用该转染细胞对9份CD36抗体阳性标本进行流式和抗体捕获法(ACA)检测。结果获得稳定表达人血小板CD36的HEK293T转染细胞；与单克隆抗体捕获血小板抗原技术( MAIPA)相比,利用CD36转染细胞建立的流式和抗体捕获法( ACA)均可检出9份CD36抗体阳性标本,且操作简便。结论稳定表达人血小板CD36转染细胞的建立,为临床上CD36抗体的检测提供了有利工具,也为今后CD36在其他疾病中作用机制的研究提供实验资料。
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HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究
目的 探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性.方法 重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性.结果 HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒.病毒滴度为5×106PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞.结论 HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒.
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采用CRISPR knockin技术实现VEGF165定点敲入HEK293T细胞系的构建
目的 构建定点敲入血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的人肾上皮细胞系HEK293T,避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应.方法 根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体(pUCm-T-VEGF165质粒)和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒],再将这两个质粒共转染HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况,蛋白质印迹法(Western Blot)检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况.结果 实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示,与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组比较,共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高(VEGF165 mRNA:3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18,均P<0.01;VEGF165蛋白:3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05,均P<0.01),EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低(EZH2 mRNA:0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16,均P<0.01;EZH2蛋白:0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06,均P<0.01).该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中,并干扰了EZH2的表达.结论 采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系.
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RNA 干扰作用于 HIV -1vpr 基因的筛选实验研究
目的：筛选鉴定针对 HlV -1vpr 基因的小干扰 RNA（siRNA）片段。方法根据 siRNA 设计要求合成siRNA56、siRNA160和 siRNA185寡核苷酸片段，分别转染至含 HIV -1vpr 质粒的 HEK 293T 细胞，并进行总 RNA 提取，采用 Real - time PCR 和 Western blotting 分别从核酸和蛋白水平对 HIV -1vpr 基因表达水平进行验证。结果siRNAs 成功转染含 HIV -1vpr 质粒的 HEK 293T 细胞，降低了 HIV -1vpr 基因的表达水平，其中在 RNA 水平 siRNA160组干扰抑制作用强，抑制率为89％；在蛋白水平 siRNA56组干扰抑制作用强，抑制率为96％。结论3个基因片段的 siRNA 均可以下调 HIV -1vpr 的表达水平，但存在差异性，为探索 HIV/ AIDS 基因治疗的可行性和高效性提供了可靠的实验依据。
关键词： RNA干扰 HIV-1 HIV-1vpr基因 HEK293T细胞 -
miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定
目的:构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平.方法:化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒.以感染复数(MOI)值为40感染HEK293T细胞48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平.结果:测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致.在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达.过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍.结论:成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞.
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EGFRvⅢ蛋白的生物信息学分析及其在HEK293T细胞中的表达
目的 对表皮生长因子受体Ⅲ(epithelial growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)突变蛋白进行生物信息学分析,并构建表达该突变蛋白的HEK293T细胞系.方法 根据NCBI公布的EGFR外显子序列,拼接成EGFRvⅢ编码基因,运用Protparam、ProtScale、SignalP 4.1 Server、TMHMM Server v.2.0、SOPMA、SWISS-MODEL和SMART软件对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.设计融合PCR引物,克隆EGFRvⅢ基因,并连接到真核表达载体pEGFP-N1上,转染HEK293T细胞,Western blot法检测EGFRvⅢ-EGFP的表达.结果 EGFRvⅢ蛋白含943个氨基酸,预测相对分子质量约为104 335;理论等电点为6.22;平均亲水性系数为-0.306,亲水性氨基酸占63.6％,疏水性氨基酸占36.4％.EGFRvⅢ蛋白N-端1～24个氨基酸序列为信号肽序列,是一个细胞质膜定位的单次跨膜蛋白.二级结构预测显示,EGFRvⅢ蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲组成,三级结构预测与二级结构预测结果一致.结构域预测显示,胞内酪氨酸激酶结构域完整,胞外受体结构域受损.融合PCR克隆出EGFRvⅢ编码基因,并在HEK293T细胞中表达出目的蛋白EGFRvⅢ-EGFP.结论 成功获得表达EGFRvⅢ蛋白的HEK293T细胞系,为开展肿瘤浸润淋巴细胞免疫治疗或T细胞受体的研究奠定了基础.
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小鼠Fancd2os基因真核表达质粒的构建及其对人胚肾上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的 构建小鼠Fancd2os基因的真核表达质粒,并分析Fancd2os基因对人胚肾上皮细胞(HEK293T)增殖和凋亡的影响.方法 以小鼠睾丸组织DNA为模板扩增Fancd2os基因cDNA全长片段,并克隆至真核表达载体p3×FLAG-CMV-14,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os.经LipofectamineTM 2000将重组真核表达质粒瞬时转染HEK293T细胞,分别采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中Fancd2os基因mRNA转录及蛋白表达情况;经CCK8法和流式细胞术分别检测过表达Fancd2os对HEK293T细胞增殖能力及紫外线诱导HEK293T细胞凋亡的影响.结果 经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os构建正确;转染p3×Flag-CMV-14-Fancd2os的HEK293T细胞可见Fancd2os基因mRNA转录及其蛋白表达;过表达Fancd2os的HEK293T细胞的增殖活性显著下降(P＜0.05);过表达Fancd2os可显著促进紫外线诱导的HEK293T细胞凋亡(P＜0.01).结论 成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-Fancd2os,过表达Fancd2os可抑制HEK293T细胞的增殖,促进其凋亡.
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聚肌苷酸胞苷酸在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活干扰素β荧光素酶报告基因系统实验条件的优化
目的 优化不同长度聚肌苷酸胞苷酸[polyinosinic acid:polycytidylic acid,poly(I∶C)]在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活I型干扰素(IFNβ)荧光素酶报告基因系统的实验条件.方法 将质粒IFN-β-1uc分别转染HEK293T及BEAS-2B细胞后,HEK293T细胞转染不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5和2.0μg/孔)的高分子量(HMW)poly(I∶C)和低分子量(LMW)poly(I∶C),检测其对HEK293T细胞中IFNβ启动子激活的影响;BEAS-2B细胞直接加入不同浓度(0.1、1.0、10.0、20.0和50.0μg/孔)及转染不同浓度(同HEK293T细胞)的HMW poly(I∶C)和LMWpoly(I∶C),检测其对BEAS-2B细胞中IFNβ启动子激活的影响.结果 poly(I∶C)转染HEK293T细胞激活IFNβ启动子的佳实验条件为:0.5 μg/孔的HMW poly(I:C)和LMW poly(I∶C)转染24 h.poly(I∶C)直接加入BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的佳实验条件为:50 μg/孔的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C)作用6h;poly(I∶C)转染BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的佳实验条件为:0.25 μg/孔的HMW poly(I∶C)转染12 h,0.5μg/孔的LMW poly(I∶C)转染12h.结论 成功优化了poly(I∶C)在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活IFNβ启动子的实验条件,为poly(I∶C)激活免疫反应机制的研究提供了实验依据.
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SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用
目的 探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用.方法 将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法 转染HEK293T细胞;在 5 μmol·L-1 的 As2O3孵育 48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法 检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及 JNK的表达变化.结果 5μmol·L-1 As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组.结论 SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关.
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二氢生物喋呤还原酶减轻脂肪酸诱导的细胞凋亡的机制研究
目的 探讨二氢生物喋呤还原酶(QDPR)高表达对脂肪酸(PA)诱导的细胞凋亡的作用.方法 HEK293T细胞转染实验分为A、B、C 3组,A组为空载体转染组,B组为经过PA刺激的空载体转染组,C组为经过PA刺激的QDPR重组质粒转染组.首先将空载体及构建的QDPR重组质粒分别转染至HEK293T细胞,培养24 h后采用0. 5 mmol/L PA刺激上述细胞,将没有经过PA刺激的空载体组细胞、PA刺激的空载体组细胞和PA刺激QDPR重组质粒组细胞三组细胞继续培养24 h后收集细胞.采用四氢生物喋呤(BH4)和活性氧簇(ROS)检测试剂盒检测3组BH4和ROS的生成量;采用Western blot法检测3组凋亡相关蛋白Beclin 1 、Caspase 3和Beclin 2的表达.结果 ①转染细胞后,QD-PR融合蛋白成功表达;②与A组相比,B组的BH4生成量差异无统计学意义;与B组相比,C组BH4生成量明显增多(P<0.05);③与A组相比,B组的ROS生成量明显增加(P<0.05);与B组相比,C组ROS生成量明显下降(P<0. 05);④Western blot结果显示:与A组相比,B组经过PA刺激后细胞中Beclin 1和Caspase 3表达水平显著上调(P< 0.05),Beclin 2表达水平下降(P<0. 05);QDPR过表达后C组Beclin 1和Caspase 3表达水平显著下调(P<0. 05) , Beclin 2表达水平升高(P<0.05).结论 QDPR高表达后,可以刺激BH4的生成,同时能降低PA诱导的ROS的生成量,还可以降低细胞凋亡相关蛋白Beclin 1和Caspase 3的表达,增强抗凋亡蛋白Beclin 2的表达,提示其可能通过调节 BH4和ROS含量影响细胞凋亡.
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miR-17对靶基因转化生长因子受体β2的负性调控表达
目的 探讨miR-17在HEK293T细胞中对转化生长因子受体β2(transforming growth factor receptor beta 2,TGFRβ2)的调控作用.方法 采用生物学信息预测软件对miRNA-17的靶基因进行预测,选定TGFRβ2为靶基因,构建pCDNA3.1+ miRNA 17重组表达载体.将HEK293T细胞分为3组,分别为对照组(无转染)、空载组(转染空质粒)和miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒),3组采用实时定量PCR检测miRNA-17和TGFRβ2mRNA表达水平,采用Western blot检测TGFRβ2蛋白表达水平.将HEK293T细胞再分为3组,分别为CTL组(转染miR-17无义寡核苷酸序列)、miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒)和ASO-miR-17组(转染miR-17反义寡核苷酸序列),采用免疫荧光法检测各组TGFRβ2荧光强度.结果 转染24 h后,空载组和miR-17组HEK293细胞处于对数生长期,细胞突起和包体均正常,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miR-17组miR-17表达量(5.391±0.053)明显高于空载组(1.654±0.075)与对照组(1.436±0.038),TGFRβ2 mRNA和蛋白表达量(2.449±0.092、1.030±0.030)明显低于空载组(6.135±0.058、5.550±0.040)和对照组(6.862±0.074、5.090±0.030) (P＜0.05);ASO-miR-17组TGFRβ2荧光强度(1.144±0.079)明显高于CTL组(0.776±0.044)和miR-17组(0.917±0.096) (P＜0.05).结论 miR-17可负性调节靶基因TGFRβ2的表达.
关键词： miR-17 转化生长因子受体β2 HEK293T细胞 靶基因 -
鱼腥草对HIV假病毒作用的初步研究
目的:观察鱼腥草体外对HIV假病毒的作用.方法:鱼腥草给予大鼠灌胃,采血制备含药血清；HIV假病毒载体pNL4-3 Luc R-E-和质粒phRL-SV40瞬时转染HEK293T细胞；含药血清刺激各组细胞,培养24 h后观察荧光察酶活性及检测P24蛋白含量.结果:实验组的荧光素酶值和P 24蛋白含量均低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:鱼腥草对HIV假病毒复制具有一定的抑制作用,推测其具有潜在的抗艾滋功效.
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利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株
目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74％、12.36％、12.54％、2.94％.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.
关键词： G6PD CRISPR/Cas9 基因敲除 HEK293T细胞 -
程序性死亡蛋白1(PD-1)在转染的HEK293T细胞的表达和鉴定
目的 优化HEK293T细胞转染条件,比较程序性死亡蛋白1(PD-1)在不同真核载体的表达水平以高效获取目标蛋白.方法 设计L9(33)正交试验,对细胞转染条件进行优化;扩增人PD-1胞外段基因,构建PD-1重组蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞,通过ELISA、Western blot对pCMV3、pcDNA3.1和pMH3三种真核表达载体的蛋白表达水平进行比较.结果 PD-1胞外段蛋白编码序列成功构建到pcDNA3.1和pMH3真核表达载体上,目的蛋白成功表达.在佳转染条件下,PD-1重组蛋白在pMH3中的表达量高,其次为pCMV3、pcDNA3.1的表达量低.结论 人PD-1胞外段蛋白在pMH3-PD1真核载体转染的HEK293T细胞中表达量高.
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可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达
目的 构建CD20真核表达载体,在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白.方法 以人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA为模板,反转录PCR扩增得到CD20基因,并插入真核表达载体pCMV3-C-His,PCR初步验证后,再测序验证.将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达,ELISA、Western blot法检测CD20蛋白表达,优化表达条件.结果 PCR与测序均显示成功插入CD20基因.转染HEK293T细胞72 h后,Western blot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白.HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关.结论 成功构建CD20真核表达载体,高效表达CD20可溶性蛋白.
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重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用
目的 构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-FcDDR2),检测其自主磷酸化水平.方法 设计FcDDR2克隆引物,以质粒pSecTag2B-FcDDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的cDNA序列(FcDDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中.PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白FcDDR2的表达效率.将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀pFLAG-CMV2-FcDDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价FcDDR2的自主磷酸化能力.结果 重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确.Western blot结果提示pFLAG-CMV2-FcDDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-FcDDR2表达水平显著上调.免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当.结论 成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,FcDDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式.
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过表达Sprouty 2分子促进HEK293T细胞增殖与存活
目的 构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK) 293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响.方法 构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响.结果 成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P＜0.05).结论 成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活.
