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胶原刺激文献资料
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重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用
目的 构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-FcDDR2),检测其自主磷酸化水平.方法 设计FcDDR2克隆引物,以质粒pSecTag2B-FcDDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的cDNA序列(FcDDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中.PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白FcDDR2的表达效率.将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀pFLAG-CMV2-FcDDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价FcDDR2的自主磷酸化能力.结果 重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确.Western blot结果提示pFLAG-CMV2-FcDDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-FcDDR2表达水平显著上调.免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当.结论 成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,FcDDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式.
