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转录因子GATA-2对iASPP基因的转录调控研究
癌基因iASPP促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,其转录起始位点上游序列有转录因子GATA-2的假定结合位点,GATA-2在造血干/祖细胞的增殖和分化中起重要作用.本研究旨在探讨GATA-2对iASPP的转录调控作用.首先检测了部分白血病细胞系中iASPP和GATA-2蛋白的表达,然后构建带有GATA-2开放读码框的真核表达载体与带有iASPP转录起始位点上游3000 bp至下游500 bp序列中GATA-2假定结合位点的荧光素酶报告载体,共转染HEK293和CV-1细胞,检测荧光素酶活性,并对荧光素酶活性上调的结合位点区进行染色质免疫共沉淀实验.结果显示,白血病细胞系中iASPP高表达的细胞大多存在GATA-2的高表达；GATA-2对iASPP报告基因荧光素酶活性有显著影响,并呈现明显的“剂量-效应”关系.当pCMV5-GATA2转染剂量上升至100 ng时,iASPP荧光素酶活性在HEK293细胞中上调到2倍；此转录激活作用在CV-1细胞中尤为显著,荧光素酶活性上调可达6.7.染色质免疫共沉淀结果证实GATA-2与iASPP转录起始区nt-361 ～-334有特异性结合.结论:转录因子GATA-2可以与iASPP的转录调控区结合,并促进iASPP基因转录.
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miR-192在肾脏和糖尿病肾病中的作用机制
本期“Smad交互蛋白1在增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响”参考文献［12］：糖尿病肾病（DN）的关键特征为细胞外基质蛋白的堆积增加，如胶原Ⅰα1和胶原Ⅱ（ColⅠα1和ColⅡ）。转化生长因子β1（TGF-β1）是这些细胞外基质基因的关键调节因子，能够增加糖尿病肾病的系膜细胞（MC ）。通过微阵列分析，我们注意到TGF-β1可增加小鼠系膜细胞（MMC）ColⅠα2的mRNA表达水平，也能降低E-box阻抑蛋白δEF1的mRNA表达水平。TGF-β1处理或短发夹RNAs （shRNAs）靶向作用于δEF1，可增加ColⅠα2基因上游E-box元件的增强子活性。TGF-β1也可减少SIP1（与δEF1相似，为另一个E-box阻抑蛋白）的表达水平。有趣的是，我们注意到SIP1是microRNA-192（miR-192）的靶点，miR-192在肾脏为主要的microRNA并高表达。MMC经TGF-β1刺激后miR-192表达增加。在MMC经TGF-β1刺激或转染miR-192可降低内源性SIP1表达，也降低SIP1的3＇-UTR荧光素酶受体活性。相反，miR-192抑制剂可提高荧光素酶活性。证实SIP1是miR-192的作用靶点。此外，miR-192与δEF1短发夹RNA协同增加ColⅠα2的荧光素酶活性。这些结果揭示了miR-192在肾脏和DN中的作用是通过下调E-box阻抑蛋白控制TGF-β1诱导的ColⅠα2表达。
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人多巴胺D2基因启动子区-350 A/G多态位点荧光素酶表达载体的构建与鉴定及活性检测
目的：探讨人多巴胺D2(DRD2)基因启动子区-350 bp位点单核苷酸多态性(rs1799978)对DRD2基因转录活性的影响,为进一步揭示DRD2基因启动子区单核苷酸多态性的功能及其对创伤应激障碍综合征易患性的分子机制奠定基础。方法以人全血基因组DNA为模板,分别扩增DRD2基因启动子区-350 bp处分别为A或G的目的片段(-1000 bp~+168 bp),与经过改建的报告基因空载体pmirGlo-promoter相连接,构建启动子区-350 bp处分别为A和G的重组荧光素酶报告基因表达载体,并通过限制性内切酶双酶切及测序进行鉴定,然后将构建好并经过鉴定的表达载体pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G分别与pRL-CMV瞬时共转染人胚肾癌细胞株HEK293,48 h后检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实,成功构建了重组荧光素酶表达载体pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G；荧光素酶活性检测结果显示,pmirGlo-promoter-G的荧光素酶基因表达量显著高于pmirGlo-promoter-A,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论成功构建了pmir-Glo-promoter-A/pmirGlo-promoter-G荧光素酶报告基因重组质粒,DRD2基因启动子区-350 bp为G时,基因转录活性较高,为A时,基因转录活性较低,说明rs1799978多态位点由A突变为G后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步深入研究DRD2基因启动子区-350 bp单核苷酸多态性的生物学功能奠定了实验基础。
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人多巴胺D2受体基因内含子区51103 T/C多态性对基因转录活性的影响
目的：探讨人多巴胺D2受体(DRD2)基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性(rs2075652)对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列(399 bp),51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmirGlo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmirGlo-T/pmirGlo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时(P<0．01)。结论成功构建了pmirGlo-T/pmirGlo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。
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肝细胞核因子3对Ⅱ型葡萄糖载体启动子活性及蛋白表达的影响
[目的]探讨在CV-1细胞中肝细胞核因子3(HNF3)对Ⅱ型葡萄糖载体(GLUT2)表达的影响.[方法]利用DNA克隆技术将HNF3 cDNA序列重组到表达载体pSV-sport上,GLUT2 cDNA克隆到载体pGL3b上.通过CV-1细胞株的体外培养将HNF3转染CV-1培养细胞,应用荧光素酶活性测定和Western blot方法观察HNF3对GLUT2的启动子活性及蛋白质表达的影响.[结果]HNF3可增高GLUT2的荧光素酶活性及蛋白质表达水平.[结论]HNF3可能通过调节GLUT2的表达参与胰岛素对血糖的调节过程.
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脊髓灰质炎假病毒的制备及其检测方法的分析
目的 分析不同试剂和方法制备脊髓灰质炎假病毒的包装效果,并比较不同检测方法的有效性.方法 比较转染试剂(PEI、polyfect、jetPRIME、Effectene)、骨架质粒转染形式(pcDNA3.1-P1与Replicon共转染;pcDNA3.1-P1转染表达24h后,转染Replicon;pcDNA3.1-P1与线性化的pRepluc共转染;pcDNA3.1-P1转染表达24h后,转染线性化的pRepluc)、衣壳蛋白质粒与骨架质粒的质量(μg)比(分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶2和2∶3)对制备假病毒效率的影响.获得的假病毒颗粒分别用报告基因荧光素酶活性检测法、荧光定量RT-PCR法、ELISA方法检测效价,并进行相关性分析.结果 单独转染衣壳蛋白质粒或骨架质粒时,转染效果佳试剂分别为jetPRIME和Effectene,当转染体系为共转染,转染试剂以Effectene为准;骨架质粒以RNA形式在衣壳蛋白转录后24h转染,或以线性化质粒形式与衣壳蛋白共转染,效果差异无统计学意义(P＞0.05);衣壳蛋白质粒与骨架质粒的比值为1∶2和1∶3时均可得到效价较高的假病毒.检测假病毒效价时,报告基因萤光素酶活性与核酸拷贝数具有一致性,病毒的核酸拷贝数与效价在0.01水平上显著相关,病毒颗粒的D抗原含量与效价在0.05水平上显著相关.结论建立了制备Sabin株假病毒的方法,并验证了荧光素酶检测假病毒效价的有效性.
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鱼腥草对HIV假病毒作用的初步研究
目的:观察鱼腥草体外对HIV假病毒的作用.方法:鱼腥草给予大鼠灌胃,采血制备含药血清；HIV假病毒载体pNL4-3 Luc R-E-和质粒phRL-SV40瞬时转染HEK293T细胞；含药血清刺激各组细胞,培养24 h后观察荧光察酶活性及检测P24蛋白含量.结果:实验组的荧光素酶值和P 24蛋白含量均低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:鱼腥草对HIV假病毒复制具有一定的抑制作用,推测其具有潜在的抗艾滋功效.
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乙型肝炎病毒调节胰岛素样生长因子结合蛋白7表达的机制研究
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)调节胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)表达的分子机制.方法 将HBV感染性克隆pHBV1.3与IGFBP7基因启动子pIGFBP7-Luc共转染HepG2细胞,并测定IGFBP7基因启动子pIGFBP7-Luc荧光素酶的活性;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测IGFBP7 mRNA和IGFBP7蛋白的表达.结果 转染pBlue-ks和pHBV1.3后,IGFBP7基因启动子pIGFBP7-Luc荧光素酶活性分别为(265.7±20.8)RUL/μg和(955.4±39.8)RUL/μg;IGFBP7 mRNA和IGFBP7蛋白的表达水平明显升高.结论 HBV通过上调IGFBP7基因启动子活性来上调IGFBP7的表达.
关键词： 乙型肝炎病毒 胰岛素样生长因子结合蛋白 荧光素酶活性 -
丙型肝炎病毒NS5A对p53活性调控机制研究
目的研究HCV NS5A对抑癌蛋白p5 3活性的抑制作用及其作用机制.方法采用荧光素酶报告基因系统观察pwwp-luc,pwwp-mut-luc,pC53-NS3及pCNS5A分别转染或共同转染HepG2、Huh7细胞的荧光素酶活性.应用凝胶滞留试验观察HCV NS5A是否影响p5 3与其特异DNA序列的结合.结果内源性p5 3能激活p21启动子转录功能,使荧光素酶活性明显增加(3.49×105与0.60×105,t=5.92,P＜0.01).外源性p 5 3也能激活p21启动子转录功能,荧光素酶活性为5.6 3×105,与对照组(0.47×105)比较差异具有显著性(t=10.12,P＜0.01).HCV NS5A能抑制内源性和外源性p5 3对p21启动子的激活作用,并呈剂量依赖性(F≥20.71,P＜0.01).凝胶滞留试验显示HCV NS5A能阻碍p5 3与其特异DNA序列的结合.结论HCV NS5A能抑制p5 3的反式激活功能使其目的基因p21启动子的转录功能下降,其机制是HCV NS5A能阻碍p 5 3与其特异DNA序列的结合.
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SLC22A3基因负性调控元件的定位
目的:拟寻找和确定人第6号染色体q26-q27区域的SLC22A3基因intron7序列中具有重要负性调控功能的核心调控元件的具体序列位置.方法:用基因重组的方法,分别构建intron7截短型野生重组质粒,分段查找该负性调控元件的具体序列位置.以包含人SLC22A3基因全长序列的细菌人工染色体为模板,PCR扩增所需截短型片段,分别插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Promoter,将重组质粒与内参质粒pRL-SV40以50:1的比例共转染HEK293T细胞,24 h后检测荧光素酶活性(luciferase activity),通过对比重组质粒和pGL3-Promoter荧光素酶活性,判断插入片段是否具有调控作用,并对发现的元件进行转录因子结合位点预测.结果:截短型野生重组质粒pGL3-pro-SLCi7-NO6,pGL3-pro-SLCi7-NO10,pGL3-pro-SLCi7-NO6.2,pGL3-pro-SLCi7-NO6.3,p-GL3-pro-SLCi7-NO10.2,pGL3-pro-SLCi7-NO6.21,pGL3-pro-SLCi7-NO10.22各组荧光素酶活性较pGL3-Promoter组降低(P＜0.05);而截短型野生重组质粒pGL3-pro-SLCi7-NO6.21-300 bp (P＞0.05)和pGL3-pro-SLCi7-NO 10.22-300 bp (P＞0.05)组荧光素酶活性较pGL3-Promoter组无统计学差异.结论:人类第6号染色体q26-q27区域的SLC22A3基因intron7序列中存在2个负性调控元件,为今后进一步对SLC22A3基因蛋表达调控方面的研究提供了理论依据.
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人BAFF-R基因启动子活性的初步研究
目的 以B淋巴细胞刺激因子受体BAFF-R基因5'上游区序列为研究对象,初步鉴定、分析该基因的启动子所在区域.方法 克隆BAFF-R基因5'侧翼区1823 bp序列,构建8个含有小同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-B1～B8,将这8个序列缺失重组质粒与psv-β-gal质粒共转染细胞.检测荧光素酶的相对活性,确定启动子所在区域.结果 8个重组质粒中pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6启动子的活性较低;pGL3-B7启动子的活性强,pGL3-B8启动子活性低.结论 BAFF-R基凶5'端-288～-430、-712～-868和-1420～-1562三个区段可能存在转录沉默子元件,-617～-712和-1277～-1420区段存在转录增强子元件,BAFF-R基因的核心启动子可能位于-1420～+261区域.
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DNA修复基因 Rad51表达调控区结构分析
目的研究DNA修复基因 Rad 51的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序 列.方法将待测片段分别克隆入pGL3报告基因载体,用磷酸钙共沉淀法转染U2-OS细胞株后 测定其荧光素酶活性.结果转染了含片段-964～+1430和片段-733～+1430 质粒的细胞有较高的荧光素酶活性,进一步缩短这两个片段,发现转染了含有-964～-412、- 746～-412、-651～-412和-536～-412片段质粒的细胞均有荧光素酶活性,活性大小依次为-964 ～-412、-651～-412、-746～-412和-536～-412.结论 Rad51基因的启动子序 列可能位于-536～-412之间,而在序列-651～-536和-964～-746之间可能存在着增强子或正转 录调节因子的结合位点,在-746～-651之间存在有抑制子或负转录调节因子的结合位点.
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肿瘤相关基因TEIF启动子区功能活性研究
TEIF基因为本实验室采用酵母单杂交的方法,从HeLa细胞cDNA文库中筛选得到的一种新基因,全长2358bp,其开放阅读框编码786个氨基酸残基的蛋白质.TEIF基因与人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子区特异性结合,增强hTERT基因的转录,进而增强端粒酶的活性,是调节端粒酶活性的特异性转录因子,其表达存在着组织、细胞系的差别.目的:探讨端粒酶调节相关蛋白TEIF对hTERT基因转录及端粒酶活性的影响.方法:引物延伸实验确定转录起始位点、采用DNA重组技术构建TEIF基因启动子荧光素酶报告基因表达体系、瞬时转染.结果:通过引物延伸实验,确定了TEIF基因的转录起始位点:位于其翻译起始位点上游-89bp处,其次,通过构建一系列启动子区报告基因重组体并通过测定和比较荧光素酶活性,我们明确了TEIF基因核心启动子区的大致范围.
