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复聪汤对年龄相关听力损失DBA/2J小鼠耳蜗外毛细胞prestin表达的影响
目的:探讨年龄相关听力损失(AHL)小鼠在服用中药复聪汤后对耳蜗马达蛋白prestin表达的影响,明确调控马达蛋白prestin表达在AHL方面的预防和治疗作用及机制.方法:采用快速老化DBA/2J小鼠,刚出生和4周龄的小鼠各40只,随机分成中药治疗组和对照组各20只.中药治疗组每天口服中药复聪汤,而对照组给予正常饮水,在治疗前及治疗1、2、3、4个月后测定ABR反应阈值.治疗4个月后,实验动物耳蜗取材,快速固定,耳蜗铺片行毛细胞记数和免疫组化荧光prestin标记染色.在光镜下对全耳蜗毛细胞进行记数,激光共聚焦显微镜进行prestin蛋白表达观察和荧光表达强度测定.结果:刚出生DAB/2J小鼠中药治疗4个月后的ABR反应阈值较对照组低,耳蜗毛细胞顶到中回的存活率高于对照组;4周龄DAB/2J小鼠中药治疗后2～3个月的ABR反应阈值较治疗前的差异不大,但均与对照组有显著差异(P＜0.01),耳蜗毛细胞顶到中回的存活率较对照组明显高,但较刚出生DAB/2J小鼠的毛细胞存活率为低.2批DAB/2J小鼠在中药治疗4个月后的耳蜗毛细胞prestin表达强度上较各自的对照组高.结论:中药复聪汤可以上调耳蜗毛细胞prestin蛋白的表达,促进耳蜗毛细胞存活,阻止毛细胞死亡的进程,从而有效预防和延缓老年性聋的发展进程,早期预防和治疗效果更好.
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哺乳动物耳蜗外毛细胞的马达蛋白:Prestin
近几年的研究发现,在耳蜗基底膜的外毛细胞膜上有一种新奇的蛋白质:prestin(马达蛋白),它能感受细胞膜电位的变化,进而发生构象改变,引发外毛细胞的形状和表面积的改变.Prestin作为一种独特的马达蛋白,能驱动耳蜗外毛细胞的电能动性(electromotility),产生耳蜗的放大器作用,因而使哺乳动物的听觉具有高度的敏感性,广阔的听觉域,敏锐的频率选择性.这种蛋白质的缺失或基因的突变会导致听觉功能严重受损,对于prestin的深入细致的研究,也许可以使人们进一步认识和理解哺乳动物的听觉调谐机制,通过对这种蛋白质基因的表达的调控,是否能够防治一些与之相关的疾病?这或许将是今后听觉研究领域的一个重要课题.
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褪黑素对小鼠放疗后内耳Prestin蛋白表达的影响
目的 探讨褪黑素(melatonin)对一次性大剂量放射治疗(放疗)后小鼠内耳Prestin蛋白表达的影响,为研究放射性内耳损伤的机制并制定预防方案提供依据.方法4周大雄性Balb/c小鼠60只完全随机分为6组,包括对照组(A组)、50mg/kg褪黑素组(B组)、5mg/kg褪黑素组(C组)、50mg/kg褪黑素+放疗组(D组)、5mg/kg褪黑素+放疗组(E组)和放疗组(F组).每个实验组再完全随机分成两组,分别于16Gy放疗后的第3、7天收集耳蜗标本行免疫组化染色及蛋白质印迹法(Westernblot)检测Prestin蛋白的表达情况.采用SPSS19.0软件进行统计分析.结果Prestin蛋白主要分布在耳蜗外毛细胞细胞核以上的侧膜,F组与A、B、C组相比,内耳Prestin蛋白表达上调,差异有统计学意义(P值均<0.05);D、E组能降低放疗后Prestin蛋白的异常表达,与F组相比,差异具有统计学意义(P值均<0.05),巨D组较E组效果显著,差异有统计学意义(P<0.05).结论耳蜗Prestin蛋白主要分布在外毛细胞细胞核以上的侧膜,接受大剂量放疗后Prestin表达上调;褪黑素可抑制放疗后Prestin蛋白的异常表达,作用与剂量相关.
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豚鼠耳蜗外毛细胞Prestin互作蛋白的识别与分析
目的 识别可与耳蜗外毛细胞Prestin互作的蛋白并分析其生物学功能,为探究Prestin 蛋白的调控及作用机制提供线索.方法 以豚鼠耳蜗为实验对象进行免疫共沉淀联合质谱技术鉴定可与Prestin相互作用的蛋白谱,使用生物信息学方法构建Prestin蛋白互作网络,通过交叉比对一级互作质谱蛋白谱与蛋白互作网络,确定豚鼠耳蜗外毛细胞Prestin的互作蛋白并进行功能注释.结果 免疫共沉淀联合质谱分析结果显示可与Prestin蛋白相互作用的可信蛋白有116种,通过构建Prestin 互作蛋白网络并与质谱结果进行匹配,经亚细胞定位后确定与Prestin具有直接互作关系的蛋白有8种:EEF2、HSP90AB1、FN1、FLNA、EEF1A1、HSP90B1、ATP5A1、ERH,其主要参与Prestin蛋白的合成转运、跨膜折叠与定位、维持蛋白的结构稳定、信号转导等方面.结论 EEF2、HSP90AB1、FN1、FLNA、EEF1A1、HSP90B1、ATP5A1、ERH通过参与Prestin蛋白的合成转运、跨膜折叠与定位、信号转导等生物学过程构建Prestin蛋白在外毛细胞特殊的跨膜结构,为实现耳蜗外毛细胞的感音放大功能提供分子基础.
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年龄相关听力损失DBA/2J小鼠耳蜗毛细胞马达蛋白-prestin表达下调与耳聋的关系
目的 老年性聋亦称年龄相关性听力损失,主要是听觉器官退行性改变所致.许多研究已证明prestin与内耳的声强感觉和频率分辨密切相关,我们推测老年性聋与耳蜗毛细胞prestin的表达具有一定的关系,本研究探讨prestin在耳蜗毛细胞表达的改变在老年性聋发病机制的作用,期望为老年性聋的防治提供依据.方法 采用快速老化DBA/2J小鼠,对4,8,16和32周龄(W)的48只小鼠进行听觉脑干诱发电位(ABR)测定.耳蜗快速取材固定,全耳蜗铺片行毛细胞记数,免疫组化荧光标记prestin在耳蜗毛细胞的表达,激光共聚焦显微镜进行观察.Western biotting进行prestin蛋白定量分析.结果 耳蜗毛细胞记数结果可见4周龄DBA/2J小鼠的耳蜗基底回有56.35％外毛细胞(outer hair cells,OHCs)消失,中回仅有个别消失,顶回有11.07％的OHCs消失;到8W时,DBA/2J小鼠的耳蜗基底回有97.85％OHCs消失,中回12.7％OHCs消失,顶回近20％的OHCs消失;16周龄时基底回OHCs完全消失,中回有80％的消失,顶回有30％的消失;DBA/2J老化小鼠到32W时,基底回OHCs已全部消失,中回也基本消失殆尽达99.5％,顶回的OHCs有80％左右消失.同时,在4W时OHCs prestin的表达从基底回到顶回均有较强的表达;到8W时耳蜗OHCs prestin的表达整体下降,与4W时相比表达下降十分显著(P≤0.01);到16W时,耳蜗OHCs prestin的表达下降更明显.与其相对应的是ABR反应阈值随年龄增长显著升高.Prestin表达与细胞核显示同时存在,OHCs消失同时prestin表达亦消失.结论 本实验结果证明,年龄相关听力损失DBA/2J小鼠的耳蜗OHCs prestin表达随听力损失而正向表达下降,毛细胞消失部位有prestin表达的消失.说明prestin表达下降是导致老年性聋的重要因素之一,其结果可能是导致老年性聋发生的分子机制之一.
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Prestin基因敲除小鼠听力和毛细胞改变的相关性研究
目的研究发育和成熟过程中的prestin基因敲除小鼠听力特征,比较其听力损害和外毛细胞(OHC)丧失的相关性,初步探讨OHC丧失的机制.方法利用听性脑干反应(ABR)、抗小鼠耳蜗毛细胞特异性的肌浆球蛋白7a(Mysojn 7a)抗体免疫染色和耳蜗连续切片观察出生后(postnatal,P)14天(P14)～P56的prestin基因敲除纯合子(prestin-/-)、杂合子(prestin+/-)和野生型(prestin+/+)小鼠听阈、耳蜗毛细胞和Corti器的改变.结果P14的prestin-/-小鼠听阈较prestin+/+升高25 dB SPL,至P21和P28,听阈分别提高49 dB和52 dB,P35后听阈改变不明显.在P21的prestin-/-小鼠,32 kHz听阈提高46 dB;prestin+/-也显示约3.5 dB的听阈升高(p＜0.0001).Prestin-/-小鼠在P28以前无明显的OHC丧失,但是,OHC的长度较prestin+/+明显缩短,P28以后,OHC丧失进行性加重.内毛细胞(IHC)丧失明显延迟和轻于OHC.结论Prestin-/-小鼠在毛细胞丧失之前呈现明显的听力损害,OHC的丧失可能与其本身的结构改变和成熟过程中的代谢异常有关.
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沙鼠耳蜗cDNA文库的构建
为了建立沙鼠耳蜗的cDNA文库,先提取沙鼠耳蜗的mRNA并经oligo(dT)引物合成cDNA第一链,经LD-PCR法扩增合成双链cDNA后,克隆到λTriplex2中扩增文库.用耳蜗特异的prestin蛋白基因引物作PCR,鉴定文库.结果显示,文库的库容量为1.8×106pfu,重组率为80%,用prestin蛋白基因引物可扩增出863bp的prestin蛋白基因.研究表明,构建的文库具有较好的库容量及重组率,且插入片段很大,为从分子生物学方面研究耳蜗打下了基础.
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大鼠Prestin-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定
目的 构建大鼠Prestin基因(SLC26A5)3'端UTR区双荧光素酶报告系统,为研究Prestin基因的microRNA调控提供基础平台.方法 以C6细胞基因组DNA为模板PCR扩增SLC26A5基因的3'UTR序列,并连接至pmri-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体多克隆位点,测序验证插入序列并转染入293T细胞检测其荧光素酶活性.结果 测序结果表明PMIR-3'UTR的插入序列正确,在转染入293T细胞后其荧光素酶能正常表达.结论 大鼠Prestin-3' UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功.
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水杨酸对C57BL/6小鼠耳蜗声损伤的作用
目的:探讨水杨酸对prestin正常表达小鼠耳蜗声损伤作用.方法:以出生18～30 d的雄性C57BL/6小鼠为研究对象,分为3组(水杨酸+噪声;0.9%氯化钠+噪声;单纯水杨酸).给予中心频率为8 kHz强度为110 dB SPL的1/3倍频程噪声暴露3 h.以听诱发脑干反应、扫描和透射电镜方法比较有、无水杨酸干预情况下小鼠耳蜗听力及形态损伤程度.用荧光定量PCR方法比较两组小鼠耳蜗prestin mRNA总量的变化情况.结果:噪声暴露后第1天,水杨酸干预组的ABR阈移较0.9%氯化钠组减少27 dB SPL;第10天减少17 dB SPL.水杨酸提前干预使耳蜗的噪声损伤后扫描电镜和透射电镜上外毛细胞及支持细胞损伤减轻.在噪声暴露后第10天,水杨酸组prestin mRNA总量较0.9%氯化钠组及噪声暴露前均升高.结论:水杨酸提前干预可以显著减轻prestin正常表达小鼠耳蜗的噪声损伤;水杨酸干预可能会导致外毛细胞马达蛋白prestin表达上升.
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水杨酸对prestin无表达小鼠耳蜗噪声性损伤的作用
目的 探讨水杨酸对prestin无表达小鼠耳蜗噪声性损伤的保护作用.方法 以出生20～28 d的prestin无表达小鼠30只为研究对象,分为A组(噪声暴露前单次注射水杨酸10只)、B组(噪声暴露前单次注射生理盐水10只)和C组(空白对照组10只).对比观察各组小鼠处理后不同时刻听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值、基底膜扫描和透射电镜情况.结果 噪声暴露后第1天和第8天,A,B两组小鼠ABR阈值均较C组显著升高,但两组间差异无统计学意义(均P＞0.05).噪声暴露后第8天,A,B两组小鼠扫描电镜观察均可见噪声损伤表现,差异不明显;而透射电镜显示B组外毛细胞胞浆内出现明显空泡化改变.结论 噪声暴露前给予水杨酸干预对prestin无表达小鼠耳蜗噪声性损伤具有轻微保护作用,这种保护作用主要反映在形态学上,并在噪声损伤后期更易显现出来.
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Prestin 在 Spag6基因敲除小鼠外毛细胞中的表达
目的：探究 prestin 在精子相关抗原6（Spag6）基因敲除小鼠中的表达及其与 SPAG6之间的关系。方法获取小鼠耳蜗基底膜组织，进行免疫染色，采用共聚焦显微镜观察 prestin 与 SPAG6在毛细胞中的共同分布。比较野生小鼠（Spag6＋／＋）、杂合型小鼠（Spag6＋／－）和同窝基因敲除小鼠（Spag6－／－）外毛细胞 prestin 的荧光强度差异和毛细胞的形态改变，并以蛋白印记实验和实时定量聚合酶链反应检测3种基因型小鼠的 prestin 表达水平。结果SPAG6存在于野生型和杂合型成年小鼠的外毛细胞中，在表皮板处呈阳性表达，与 prestin 共同分布于外毛细胞的外侧壁处。基因敲除小鼠 prestin 的荧光强度较野生小鼠更弱，并且外毛细胞出现形态异常。蛋白印迹实验和实时定量聚合酶链反应均显示，基因敲除小鼠 prestin 表达量显著降低。结论SPAG6参与外毛细胞的构成，且影响外毛细胞 prestin 表达，提示两种蛋白之间存在相互作用。
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氧化应激损伤与HEI－OC1细胞株中Prestin表达的相关性分析
目的：观察氧化应激损伤对 HEI－OC1细胞Prestin表达的影响，探讨感音性聋的发生机制。方法采用不同浓度（50、100、200μM）双氧水（H2 O2）染毒培养的 HEI－OC1细胞（染毒组），对照组细胞加入无药物培养液，24 h后检测各组细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力，实时荧光定量PCR检测Prestin mRNA表达水平，免疫荧光法分析Prestin表达水平。结果与对照组相比，氧化应激损伤后染毒组的 HEI－OC1细胞SOD活力明显下降，尤以200μM H2O2染毒组下降更明显（F＝9926．293，P＜0．01）；氧化应激损伤的 HEI－OC1细胞 Prestin mRNA和Prestin蛋白表达水平均明显下降，200μM H2O2染毒组下降更明显（F＝4065．046、7657．217，P＜0．01）。结论氧化应激损伤可抑制Prestin的表达，此为感音性聋的重要病理学变化。
关键词： 氧化应激 HEI-OC1 细胞 prestin -
乳鼠耳蜗单离外毛细胞胞膜Prestin分布的实验研究
目的 探讨乳鼠耳蜗外毛细胞(OHC)细胞膜上动力蛋白Prestin的分布.方法 获取7日龄的Wistar乳鼠单离的耳蜗OHC,利用Prestin特异性抗体染色,在荧光显微镜下观察Prestin在OHC细胞膜上的表达与分布.结果 单离OHC侧膜存在较为均一的Prestin抗体阳性染色;OHC基底部细胞膜亦见阳性染色,但较弱;侧膜与底端细胞膜结合部位未见阳性染色.结论 Prestin主要分布在Wistar乳鼠耳蜗OHC的侧膜,基底部膜也有少量表达.
