首页 > 文献资料
-
基因敲除技术在结核病研究中的应用
1989年,美国科学家Capecchi通过研究胚胎干细胞同源重组原理获得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi与美国科学家Smithies、英国科学家Evans共同分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,成为基因敲除研究史上的又一里程碑.经过20多年的不断发展,基因敲除技术(gene knock-out)已经广泛应用于生物医学的各个研究领域,尤其在结核病研究中取得了很大进展,基因敲除技术已成为研究结核病发生、发展机制的重要技术手段.笔者综述了基因敲除技术的原理及其在结核病研究中的应用.
-
电针对酸敏感离子通道3基因敲除小鼠心肌缺血后损伤的影响
目的:观察电针对小鼠心肌缺血后损伤的影响,探讨酸敏感离子通道3(ASIC3)在其中的作用.方法:选用C57BL/6与ASIC3基因敲除(ASIC3-/-)小鼠建立心肌缺血模型,检测针刺前后心电图.结果:针刺后,与造模后比较,两种小鼠电针组ST段和T波降低(P＜0.01);与ASIC3-/-小鼠比较,C57BL/6小鼠ST段和T波降低更加明显.结论:电针内关穴可改善心肌缺血后损伤,机制之一可能是通过激活传入纤维末梢的ASIC3受体通道,抑制交感神经,治疗心肌缺血.
-
脑内源性cPKC gamma水平影响缺血性卒中小鼠脑梗死体积和神经功能损伤
目的 探讨脑内源性经典型蛋白激酶C(cPKC)γ表达水平对脑中动脉阻塞(MCAO)/再灌注(R)致缺血性脑卒中小鼠脑梗死体积和神经功能损伤程度的影响.方法 利用cPKCγ基因野生型(WT)、杂合型(HET)和敲除型(KO)小鼠,建立小鼠1 h MCAO/R 24 h和7d缺血性脑卒中模型,借助Western blot蛋白印迹、2,3,5-氯化三苯基四唑(TTC)染色、神经行为学测试等技术方法,检测脑内源性cPKCγ蛋白表达水平、脑梗死体积和神经功能损伤情况.结果 MCAO/R 1 h/24 h和7d可使WT、HET和KO小鼠脑出现明显的梗死灶和神经功能损伤；具有双拷贝基因的WT小鼠脑内cPKCγ蛋白表达量存在个体差异的同时,只有单拷贝基因的HET小鼠脑内cPKCγ蛋白表达水平约为WT型小鼠的30％ ～ 100％,而非简单的50％；脑内源性cPKCγ蛋白表达量与卒中脑梗死体积大小呈明显的负相关性,且神经功能损伤程度随着脑内cPKCγ蛋白表达水平的增高而明显减轻.结论 脑内源性cPKCγ蛋白表达水平可影响缺血性卒中小鼠脑梗死体积和神经功能损伤程度.
关键词： 缺血性脑卒中 蛋白激酶C(PKC) 脑梗死体积 神经功能损伤程度 基因敲除小鼠 -
基因敲除鼠在动脉粥样硬化研究中的应用
ApoE和LDL-R基因敲除鼠可自发形成动脉粥样硬化斑块,是动脉粥样硬化研究的常用模型.在此基础上应用基因打靶技术建立的白介素-1、C反应蛋白、清道夫受体、Igc Fc、补体Clq及CD44等模型对研究动脉粥样硬化中炎症和免疫因子的作用机制起了重要作用.
-
补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响
目的:观察补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响.方法:81只补体C3基因敲除小鼠随机分三组(n=27):A组:假手术组；B组:慢性坐骨神经结扎模型(CCI)组；C组:CCI模型补体C3干预组.测定小鼠的热痛阈值和机械痛阈值,并取腰5、6脊髓节段测定GFAPmRNA和GFAP表达.结果:术前三个组小鼠热和机械痛阈无明显差异,术后1天A组热和机械痛阁下降,其后恢复.B组和C组继续下降,C组下降幅度更大(P＜0.05).术后第1天,B组和C组胶质细胞激活轻微,术后第3、7天B组和C组脊髓组织GFAPmRNA和GFAP表达量逐渐增加,且C组其表达量明显高于B组.结论:补体C3的存在与神经病理性模型小鼠星形胶质细胞激活显著相关,并由此影响到慢性疼痛状态的出现和维持.
-
肾脏D5多巴胺受体表达参与了血管紧张素Ⅱ 1型受体基因敲除小鼠低血压的发生
目的 肾脏血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)的保钠潴水功能部分可以解释AT1R基因敲除(AT1A-/-)小鼠血压降低的原因,然而,对于是否有AT1R以外的机制参与则研究较少.既往的研究间接提示D5多巴胺受体和AT1R之间存在相互抑制作用,因而在本实验中,将验证D5受体的因素是否参与AT1A-/-小鼠低血压的发生.方法 在比较AT1A-/-小鼠和其对照(AT1A+/+)小鼠血压、尿钠排泄、肾脏D5受体表达的基础上,利用Wistar-Kyoto(WKY)大鼠的肾近曲小管(RPT)细胞株和D5受体转染HEK293细胞为研究对象,研究AT1R和D5受体之间的交互影响,探讨AT1A-/-小鼠血压降低的原因.结果 与AT1A+/+小鼠相比,低盐饮食的状况下AT1A-/-小鼠血压较低、尿钠排泄能力增强,肾脏D5受体表达量增加.在WKY大鼠肾近曲小管的细胞上,刺激AT1R可特异地抑制D5受体的表达;反过来,刺激D5受体转染HEK293细胞的D5受体也可抑制AT1R的表达.结论 D5受体的高表达可能参与了AT1A-/-小鼠血压降低的发生机制.
关键词： 多巴胺受体 血管紧张素Ⅱ 1型受体 血压 肾脏 基因敲除小鼠 -
Prx1基因敲除小鼠模型的构建
目的 建立Prx1(Peroxiredoxin 1)基因敲除小鼠模型.方法 体外培养Prx1基因捕获小鼠ES(胚胎干)细胞,利用显微注射方法将ES细胞注射入C57BL/6小鼠囊胚腔,通过胚胎移植将注射后的囊胚引入受体小鼠子宫,将高嵌合率小鼠与C57BL/6小鼠杂交,利用毛色遗传和PCR技术对子代鼠进行鉴定.结果 通过对F1代小鼠的毛色遗传和PCR基因型鉴定,Prx1基因捕获ES细胞能够整合到小鼠生殖系,并稳定遗传.结论 成功获得Prx1基因敲除小鼠.
-
金属硫蛋白基因对小鼠变应性接触性皮炎的影响
目的:探讨金属硫蛋白(metallothioneins ,MTs)在小鼠变应性接触性皮炎中所起的作用.方法:用二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene ,DNFB)致敏金属硫蛋白基因敲除小鼠(metallothionein-null mouse,MT-/-,不表达MT-I及MT-II)及基因同源对照野生型鼠(MT+/+,正常表达MTs),并在小鼠右耳激发变应性接触性皮炎,分别对比两组小鼠激发后耳肿胀度.结果:野生型鼠(MT+/+)耳肿胀度明显高于基因敲除鼠(MT-/-),统计学分析差异有显著性(P<0.05,t检验).结论:MTs在迟发型变态反应的炎症过程中起重要作用,MT-/-小鼠不能完全表达迟发型变态反应的炎症.
-
基因修饰小鼠的骨性关节炎模型研究进展
目的：搜集整理近年来国外关于基因修饰小鼠在骨性关节炎（OA）研究，以便了解其动态发展状况。方法通过注射关节腔内5种不同致病因子及手术切除4种模式来人工制造类似骨关节炎的病理模式。结果经过基因敲除的小鼠具有基因趋同性和稳定性，使实验数据更为准确和客观。结论基因敲除后的小鼠种群较适合于骨性关节炎的人工造模。
-
血红素加氧酶-1基因敲除小鼠的饲养和鉴定
目的 繁殖并鉴定HO-1基因敲除(HO-1-/-)小鼠.方法 将引进的HO-1基因敲除杂合子小鼠,进行SPF级饲养,与C57BL/6野生型小鼠配种繁殖,提取子代小鼠的基因组DNA,PCR法特异性扩增HO-1基因片段,使用双脱氧测序法测得基因序列.子代小鼠出现3种基因型:野生型、杂合子型及纯合子型.杂合子小鼠进一步配种繁殖,以获得更多的基因敲除纯合子小鼠,纯合子小鼠用以课题研究.结果 HO-1基因敲除杂合子小鼠的饲养和繁殖均获得成功,获得了HO-1基因敲除纯合子和杂合子小鼠.结论 正确的饲养繁殖及鉴定方法是从HO-1基因敲除杂合子小鼠中获得纯合子小鼠的有效途径.
-
补体C3基因敲除小鼠的繁育及子代基因型鉴定
目的 探讨繁殖和鉴定补体C3基因敲除小鼠的实验方法.方法 将所引进的补体C3基因敲除杂合子小鼠(C3+/-)进行饲养并繁殖,其子代出现三种基因型的小鼠,即纯合子C3-/-、杂合子C3+/-、野生型C3+/+,采用ELISA与PCR相结合对子代小鼠基因型进行鉴定.结果 繁育出135只子代小鼠,经鉴定,C3+/+、C3+/-、C3-/-各为38只、68只、29只,经x2检验,子代小鼠分离比例符合孟德尔遗传规律.结论 正确的饲养繁殖以及子代鉴定是从杂合子小鼠中获得补体C3基因敲除小鼠的有效途径.
-
Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立
目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库.方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率.结果 两组不同杂交组合(Smad2+/-♂×Smad2+/-♀和Smad2+/-♂×Smad2+/-♀)小鼠平均超排卵数分别为14.13枚和24.60枚;复苏率分别为90.16%和91.67%;囊胚发育率分别为73.08%和77.05%.这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异.因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚.结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库.
-
基因敲除小鼠肝病模型的研究进展
基因敲除是研究基因功能的有效手段.通过基因敲除技术建立的小鼠肝病模型,在研究基因功能及人类疑难病症致病机制等方面发挥着重要作用.本文对目前已获得的基因敲除小鼠肝病模型进行了分类和总结,为相关研究的展开打下了一定基础.
-
p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定
目的 为了繁育和鉴定p53基因敲除小鼠,将引进的杂合子小鼠进行饲养繁殖,杂合子用于继续保种.方法 对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定.结果 对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到纯合基因缺失型小鼠.结论 正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意义.
-
WIP1对小鼠B细胞及T细胞发育的影响
目的 研究WIP1基因对小鼠骨髓B细胞发育及胸腺T细胞发育的影响.方法 流式细胞术测定小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞发育中各阶段的细胞比例.结果 虽然WIP1缺失小鼠骨髓B细胞发育各阶段比例正常,但骨髓总体B细胞比例下降;WIP1基因敲除小鼠胸腺发育障碍,CD8/CD4双阴性细胞比例增高,CD8/CD4双阳性细胞比例降低.结论 WIP1基因在小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞的发育过程中起重要作用.
-
FOXO3A基因敲除小鼠繁殖鉴定及骨髓造血干细胞表型初步分析
目的 繁育和鉴定FOXO3A基因敲除小鼠,选育的FOXO3A基因敲除杂合型小鼠用于保种,纯合型小鼠用于实验.初步分析FOXO3A基因敲除对小鼠造血细胞表型的影响,为后续FOXO3A基因对造血细胞损伤的调节研究奠定基础.方法 杂合型雌鼠与野生型雄鼠交配,选育出杂合型雌鼠和杂合型雄鼠,采用一雄一雌或一雄两雌同笼合养方式进行繁育获得纯合型小鼠;繁育的幼鼠剪趾标号,剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定,鉴定获得100 bp/186 bp两条条带的为杂合型小鼠(FOXO3A+/-),鉴定获得186 bp条带的为纯合型小鼠(FOXO3A-/-),鉴定获得100 bp条带的为野生型小鼠(FOXO3A+/+,WT);采用流式细胞术对鉴定出的野生型和纯合型小鼠进行骨髓细胞分型分析.结果 FOXO3A基因敲除小鼠已成功繁殖鉴定,子代基因敲除纯合型小鼠与杂合型小鼠长势正常,与野生型FVB/N小鼠相比外观、生长发育未见明显差异;已得到一定数量的纯合型小鼠用于后续实验;骨髓细胞计数结果显示,FOXO3A基因敲除纯合型小鼠骨髓有核细胞计数与野生型小鼠相比[(6.167±1.424)vs.(10±1.732)],未见明显差异(P=0.1625);流式分析结果显示:FOXO3A基因敲除小鼠骨髓中造血祖细胞(lin-scal-1-ckit+,HPC)比例明显升高(P<0.05),造血干细胞(lin-scal-1+ckit+,HSC)比例没有明显差异;造血干细胞和造血祖细胞数目未发现有明显差异(P>0.05).结论 经基因型鉴定已成功获得FOXO3A基因敲除小鼠.初步探讨FOXO3A基因敲除对小鼠骨髓细胞计数及分型未见明显影响,FOXO3A基因敲除对小鼠造血细胞的影响需要进一步的实验加以证明.
-
利用 CRISPR／Cas9技术构建 miRNA－29 b1基因敲除小鼠
目的：应用CRISPR／Cas9技术构建miRNA－29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA－29b1基因设计一段sgRNA，sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL／6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型，同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA，通过real－time PCR分析miRNA－29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA－29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录，显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA－29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型，一种为10 bp的缺失突变；另一种为22 bp的缺失突变，同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比，基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA－29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR／Cas9技术成功构建miRNA－29b1基因敲除小鼠。
关键词： CRISPR/Cas9 miRNA-29b1 基因敲除小鼠 -
Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响
目的 Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能的影响.方法 流式细胞仪分选小鼠骨髓造血干细胞、体外单克隆培养,竞争性骨髓移植,放射线照射观察生存曲线.结果 Gadd45a基因缺失的小鼠造血干细胞克隆形成能力增强,短期造血重建能力无差异,8.5Gy放射线照射后生存情况无差异.结论 Gadd45a基因对小鼠造血干细胞功能起重要作用.
-
心房钠尿肽在基因敲除小鼠黑色素瘤肺转移中的作用
目的 探讨心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)对黑色素瘤肺转移的作用.方法 将体外培养的黑色素瘤B16F10细胞株通过尾静脉注射到心房钠尿肽敲除小鼠( ANP-/ -小鼠)和C57BL／6J小鼠的体内,建立黑色素瘤肺转移模型,模型建立后第21天计数转移到肺表面的结节数目,并把肺组织包埋固定、切片、HE染色后,确定肺转移结节并计数.结果 ANP敲除小鼠肺表面转移的黑色素瘤结节数明显比C57BL／6J小鼠少,差异有显著性;ANP敲除小鼠肺微转移结节数目也明显比C57BL／6J小鼠少,差异有显著性.结论 ANP敲除显著抑制了黑色素瘤的肺转移.
-
基质金属蛋白酶-9在动脉粥样硬化血管中的异常表达
目的 了解基质金属蛋白酶-9 在Apo-E 基因敲除小鼠的动脉粥样硬化斑块血管中的表达.方法 8 只5 周龄,雄性SPF 级C57BL/6J 小鼠为对照组(NS 组).8 只相同周龄,雄性SPF 级载脂蛋白E 基因敲除(C57BL/6J-ApoE-/-)小鼠为实验组(FS 组).高脂(1% 胆固醇+15% 猪油)喂食15 周,20 周龄取材检测.结果 FS 组和NS 组体重分别为(29.10±2.53) g 和(33.20±5.18) g,差异无统计学有意义(P ＞ 0.05).FS 组较NS 组血清总胆固醇显著增高,分别为(13.52±1.58) mEq/L 和(2.12±0.35) mEq/L,差异有统计学有意义(P ＜ 0.01).NS 组主动脉管壁正常,无AS 斑块;FS 组主动脉出现典型的AS 斑块,胶原纤维明显减少.免疫组化显示NS 组可见主动脉血管内、中膜MMP-9 呈散在弱阳性表达;而其在FS 组则是内膜表达明显增高,呈强阳性表达.FS 组主动脉弓MMP-9 在mRNA 及蛋白水平的表达较NS组均明显增高.mRNA 平均光密度值为(11.61±1.92)和(1.52±0.40),差异有统计学意义(P ＜ 0.05);蛋白平均光密度值为(190.40±102.71)和(40.19±26.83),差异有统计学有意义(P ＜ 0.01).结论 在高脂喂食的载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中,MMP-9 高表达可能与动脉粥样硬化斑块的形成和胶原纤维明显减少有关.
