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低氧预适应小鼠脑海马组织内与cPKCγ相互作用的ERK1/2磷酸化水平降低
目的 探讨与经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)相互作用的细胞外信号调节激酶1//2(ERK1/2)的磷酸化水平在小鼠脑低氧预适应形成过程中的变化.方法 用成年雄性BalB/c小鼠制备整体低氧预适应模型,将小鼠随机分为正常对照(H0)、早期低氧预适应(H3)和延迟性低氧预适应(H6)3组.应用免疫共沉淀,Western blot等方法检测胞质和膜相关成分中与cPKCγ相互作用的ERK1/2的磷酸化水平.结果 小鼠海马组织中ERK1/2能与cPKCγ免疫共沉淀,且与HO组相比,H3及H6组ERK1/2的204位酪氨酸磷酸化水平明显降低(P<0.05).结论 小鼠海马组织中,cPKCγ与ERK1/2存在相互作用,且可能参与了脑低氧预适应的发生和发展.
关键词： 脑低氧预适应 蛋白激酶C 细胞外信号调节激酶1/2 免疫共沉淀 -
延迟性低氧预适应降低小鼠脑皮质cPKCγ蛋白表达
目的探讨cPKCα和γ膜转位水平及蛋白表达量在延迟性脑低氧预适应形成过程中的变化.方法应用SDS-PAGE和Western bolt等技术,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测延迟性脑低氧预适应小鼠(H5和H6组)脑组织内cPKCα和γ的膜转位水平及蛋白表达量.结果延迟性低氧预适应(H5和H6组)明显降低小鼠脑皮质组织内cPKCγ蛋白表达量(P＜0.05),而膜转位(活性)水平变化不显著.对海马cPKCγ、大脑皮质和海马cPKCα蛋白表达量及膜转位水平的影响均不显著.结论大脑皮质cPKCγ蛋白表达量的改变可能参与延迟性脑低氧预适应形成,且可能与皮质和海马低氧选择易损性的差异有关.
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P38 MAPK磷酸化水平增高参与HPC降低MCAO所致小鼠缺血性脑损伤
目的 探讨P38丝裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)磷酸化和蛋白表达水平在低氧预适应(HPC)降低脑中动脉阻塞(MCAO)所致缺血性脑损伤中的变化.方法 利用已建小鼠HPC-MCAO模型,将健康雄性BALB/c小鼠随机分为常氧假手术(H0 Sham)、HPC假手术(H4 Sham)、常氧缺血(H0)和HPC缺血(H4)4组,应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、Nissl染色等方法 观察脑损伤情况,应用Western blot并结合Gel Doc凝胶成像系统,定量检测小鼠脑组织内P38 MAPK磷酸化和蛋白表达水平的变化.结果 HPC可明显减小MCAO所致的脑梗死体积(P＜0.05).与H0 Bhaln相比,缺血组小鼠皮层缺血核心区和半影区P38 MAPK磷酸化水平显著升高(P＜0.05,n=6),HPC可进一步增加缺血半影区和对侧皮层组织中P38 MAPK磷酸化水平(P＜0.05,n=6).各组间P38MAPK蛋白表达量水平无明显变化.结论 P38 MAPK可能参与了HPC降低MCAO所致小鼠缺血性脑损伤的作用.
关键词： 脑低氧预适应 脑中动脉梗塞 p38丝裂原激活蛋白激酶 磷酸化水平 蛋白表达量 -
低氧预适应升高小鼠脑内JNK磷酸化水平和蛋白表达
目的探讨C-JUN氨基末端激酶或应激激活蛋白激酶(JNKs/SAPKs)在脑低氧预适应发生、发展过程中的作用.方法将小鼠整体低氧预适应模型中BALB/C小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1～H4组)和延迟性(H5～H6组)低氧预适应等7组.应用SDS-PAGE和Western bolt方法,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测大脑皮层和海马组织内JNK1和JNK2/3的磷酸化水平及其蛋白表达量的变化.结果在早期低氧预适应形成过程中,随低氧次数的增加,小鼠大脑皮层和海马组织内JNK1的磷酸化水平(未检测到磷酸化的JNK2/3)逐渐升高,且以皮层内(H1和H2组)和海马组织内(H1～H4组)的增高明显(P＜0.05,n=6);而JNK1和JNK2/3只在延迟性低氧预适应(H5～H6组)发展过程中明显上调(P＜0.05,n=6).结论JNK1的激活以及JNK1和JNK2/3蛋白表达量的增高可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生和发展.
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低氧预适应小鼠脑组织内P38 MAPK磷酸化水平增高
目的 探讨P38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)在小鼠脑低氧预适应形成过程中的作用.方法 用成年雄性BALB/c小鼠制备小鼠整体低氧预适应模型,小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1～H4)和延迟性(H5～H6)低氧预适应等7组;应用Western bolt并结合Gel Doc凝胶成像系统,定量检测小鼠脑组织内P38 MAPK磷酸化水平和蛋白表达量.结果 与H0组小鼠相比,H2～H6组的海马和皮层及H3～H6组的下丘脑中P38 MAPK磷酸化水平明显增高 (P＜0.05,每组n=6);H1～H6组的皮层、海马和下丘脑中P38 MAPK蛋白表达量无明显变化.结论 P38 MAPK磷酸化激活而非蛋白表达量的变化可能参与了小鼠脑低氧预适应的发生、发展过程.
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低氧预适应增加小鼠脑组织蛋白激酶C膜转位
初步探讨蛋白激酶C(PKC)在脑低氧预适应发生机制中的作用,以我室建立的小鼠低氧预适应模型,结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western bolt)等生化技术,观察了低氧预适应对小鼠大脑皮层及海马组织内PKC膜转位的影响.结果表明,在小鼠大脑皮层和海马组织内的PKC膜转位均随着低氧次数(小鼠低氧耐受时间)的增加而增高.特别是低氧3次的海马组织和低氧4次的大脑皮层和海马组织内,PKC膜转位的增加有统计学显著意义.结果提示,PKC的激活可能在脑低氧预适应发生机制中具有重要的作用.
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一种小鼠离体海马脑片细胞外记录技术
离体脑片是用特制的组织切片机切制而成的脑组织切片.利用脑片进行功能研究基本的指标是突触传递引起的电活动.细胞外记录技术是进行这种记录常用的方法之一.我室20世纪60年代发现并报道了脑低氧预适应现象[1],并建立了小鼠低氧预适应动物模型.在这一独特的低氧预适应模型上,建立海马脑片诱发电位的记录方法,对于进一步深入研究低氧预适应机制是十分必要的.
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低氧预适应增加小鼠脑组织内nPKCε膜转位
目的:初步探讨新奇型蛋白激酶C(novel protein kinases C,nPKCs)在脑低氧预适应发生发展过程中的作用.方法:利用蛋白电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)等生化技术,并结合本室已建立的小鼠低氧预适应模型,观察低氧预适应对小鼠海马和大脑皮层组织内nPKCs(nPKCε、δ、η、μ和θ亚型)膜转位(激活)的影响.结果:随低氧次数(H0-H4)或低氧耐受时间的增加,小鼠海马(H0:41.6%±1.4%vs H1-H4:46.9%±4.5%,52.7±3.9%,58.8%±2.7%,61.3%±3.7%)和大脑皮层(H0:38.4%±4.5%vsH1-H4:42.4%±5.0%,48.7%±6.5%,55.3%±8.9%,61.2%±10.2%)组织内nPKCε膜转位明显增加,且海马和大脑皮层分别在H2、H3、H4和H3、H4具有统计学的显著意义(P＜0.01);而nPKCδ、η、μ和θ亚型在海马和大脑皮层组织内的膜转位变化均无统计学意义.结论:nPKCε可能在脑低氧预适应的发生发展过程中发挥着重要作用,但需进一步的研究证实.
关键词： 脑低氧预适应 新奇型蛋白激酶C(nPKCs) nPKCε膜转位 海马 大脑皮层 -
低氧预适应小鼠脑内ERK1/2磷酸化水平和蛋白表达量的改变
目的:初步探讨细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)在脑低氧预适应发生发展过程中的作用.方法:按已建小鼠整体低氧预适应模型,将BALB/C小鼠(18～22 g,雌雄不限)随机分为正常对照(H0)、早期(H1-H4)和延迟性(H5-H6)低氧预适应等7组(每组至少6只动物).应用SDS-PAGE和Westem blot等生化技术,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测小鼠脑组织内ERK1/2的磷酸化水平和蛋白表达量.结果:①早期低氧预适应形成过程中,随低氧暴露次数的增加(H1-H4),小鼠海马和皮层组织内ERK1/2磷酸化水平显著降低(P<0.05,n=6),而ERK1/2蛋白表达量并无显著变化;②延迟性低氧预适应中(H5-H6),小鼠大脑皮层和海马组织内ERK1/2的蛋白表达量显著降低(P<0.05,n=6).结论:ERK1/2的活性降低(磷酸化水平降低),以及ERK1/2蛋白表达量下调可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生发展过程.
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OGD增加小鼠离体海马组织内cPKC βⅡ和nPKCε的膜转位
目的:通过观察无糖低氧(OGD)刺激对小鼠海马脑片内蛋白激酶C(PKC)特定亚型膜转位水平(激活程度)的影响,进一步证实我们在整体低氧预适应小鼠模型上所获实验结果,并为离体海马脑片缺血/低氧预适应(I/HPC)模型建立及后续药物干预实验打下基础.方法:急性分离小鼠海马组织、制备400μm厚度的脑片,并用无糖低氧(OGD)人工脑脊液(ACSF)模拟缺血/低氧刺激;应用SDS-PAGE和Western bolt等生化技术,并结合GelDoc凝胶成像系统,半定量检测OGD刺激2、5、10、15和30min后海马脑片内cPKCβⅡ和nPKCε的膜转位水平.结果:OGD刺激可增高海马脑片内cPKCβⅡ和nPKCε的膜转位水平,且这种增高从刺激5 min开始持续至30 min均有显著差异(P＜0.001,n=6).结论:实验结果进一步证实cPKCβⅡ和nPKCε可能参与脑缺血/低氧性预适应的形成过程,并提示OGD 10 min作为制备离体海马脑片I/HPC模型的预处理刺激较为合理.
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低氧预适应鼠脑内核糖体S6激酶磷酸化水平和蛋白表达量的变化
探讨核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase, RSK) Ser221(PDK1磷酸化位点)和Thr359/Ser363(ERK1/2磷酸化位点)的磷酸化水平以及总RSK蛋白表达量在小鼠脑低氧预适应发生发展过程中的变化.将成年雄性BALB/c小鼠(18～22 g)随机分为正常对照(H0)和重复性低氧1～4次(H1～H4)等5组(每组n=6).应用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)技术,定量检测整体低氧预适应小鼠海马和皮层组织内Ser221位点(p-Ser221 RSK)和Thr359/Ser363位点(p-Thr359/Ser363 RSK)的磷酸化水平以及总RSK蛋白表达量.结果表明,随着低氧暴露次数增加,小鼠海马和皮层组织内p-Ser221 RSK磷酸化的水平显著增高(P＜0.05, n=6),伴随着p-Thr359/Ser363 RSK磷酸化的水平明显降低(P＜0.05, n=6);而RSK总蛋白的表达量则无明显改变.结果提示,Ser221 RSK磷酸化水平增高和Thr359/Ser363 RSK磷酸化水平降低可能参与了小鼠脑低氧预适应的发生发展过程.
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重复性低氧增高小鼠脑组织内CREB的磷酸化水平
为探讨cAMP反应元件结合蛋白(CREB)在小鼠脑低氧预适应形成过程中的作用,本研究应用Western blot技术结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测了整体低氧预适应模型小鼠脑组织内CREB的磷酸化水平和非磷酸化水平的表达水平.结果显示:(1)随低氧暴露次数(H1-H4)的增加,小鼠海马组织内CREB的磷酸化水平(激活程度)明显增高(P＜0.05;n=7);同样,大脑皮层内CREB的磷酸化水平也随低氧暴露次数(H1-H4)的增加而明显增高(P＜0.05,n=7);(2)随低氧暴露次数(H1-H4)的增加,CREB的蛋白表达量无论在小鼠海马组织还是皮层组织内均无明显变化.以上结果提示CREB磷酸化水平的增高(激活)可能参与了脑低氧预适应的形成过程.
