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幽门螺杆菌诱导人胃上皮细胞系(GES-1)发生自噬
目的 观察幽门螺杆菌感染人胃上皮细胞后自噬的发生及变化情况,为进一步研究幽门螺杆菌感染后诱发自噬反应的相关研究奠定基础.方法 采用中性红摄入法确定H.pylori感染GES-1细胞的浓度,并以此浓度感染GES-1细胞不同时间.通过Western blot检测感染不同时间点GES-1中LC3Ⅰ/Ⅱ或P62蛋白表达,免疫荧光染色观察自噬体的出现.在使用自噬抑制剂3MA、E64d、pepstatin A处理被感染的GES-1后,利用上述方法监测细胞自噬变化情况.结果 H.pylori(22695)感染GES-1细胞佳浓度为m.o.i =400.在GES-1细胞被感染后2h即可观察到自噬的发生,且呈时间依赖性,于8 h到达高峰,24h开始恢复基础水平.使用3MA处理细胞后自噬水平降低,自噬体明显减少.使用E64d和pepstatin A阻断被感染细胞中自噬溶酶体的形成,LC3Ⅰ/Ⅱ与P62蛋白因无法通过自噬途径降解而较未处理组增加.结论 H.pylori(22695)能够诱导人胃上皮(GES-1)发生自噬,且能被自噬调节剂调控.
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BCL-2 基因转染的人胃黏膜上皮细胞株GES-1的建立与鉴定
目的 构成BCL-2基因表达的人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞模型.方法 质粒pcDNA3-BCL-2 经酶切鉴定后,以脂质体法转染人胃黏膜上皮细胞GES-1,经G418筛选获得细胞克隆,荧光免疫组化法鉴定BCL-2基因表达阳性细胞.结果 经酶切鉴定为携带BCL-2基因的质粒pcDNA3-BCL-2,荧光免疫组化结果显示7个克隆中,均有不同程度的BCL-2基因表达.BCL-2主要表达在胞质及细胞核膜.结论 GES-1细胞为BCL-2表达阳性的细胞,为进一步研究BCL-2基因与胃癌的关系提供了理想的细胞模型.
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c-myc基因在EBV转化人胃上皮细胞中的作用
目的 研究EBV感染人胃上皮细胞系GES-1后c-myc基因的表达状况及转化作用,以探讨c-myc基因在Epstein-Barr病毒(EBV)相关胃癌发生中所起的作用.方法 用携带NEOr基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,采用脂质体介导法将c-myc基因转染至同一细胞,以pcDNA3空载体质粒转染同一细胞为对照;经G418筛选获得感染或转染的抗性细胞克隆;采用免疫细胞化学法测定EBNA1的表达以鉴定EBV感染细胞克隆,测定EBV感染和c-myc基因转染细胞中C-myc蛋白的表达;通过形态学观察、细胞生长曲线测定及流式细胞分析等方法观察细胞生物学特性的变化.结果 与对照组相比,EBV感染及c-myc转染后细胞发生明显的形态学变化,生长速度明显加快,S期细胞比例显著提高,分别为(70.96±0.91)%和(60.67±3.06)%vs(34.74±1.03)%,P＜0.05,表明EBV感染及c-myc基因转染均使细胞增殖加快.结论 EBV感染及c-myc基因转染可使人胃上皮细胞的增殖速度加快,细胞恶性程度增强,但并未导致肿瘤的发生.EBV对人胃上皮细胞的转化作用可能与c-myc基因的过度表达有关.
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EB病毒对人胃上皮细胞易感性及细胞周期素D1表达的影响
①目的 探讨EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)对人胃上皮细胞GES-1易感性及细胞周期素D1表达状况的影响.②方法 用携带产EBV的B95-8细胞系制备EBV,感染人胃上皮细胞GES-1；用有限稀释法对感染细胞进行克隆,观察细胞的形态,并用PCR法检测来感染及感染细胞中EBV编码核抗原EBNA1、EBNA2、潜伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A、裂解感染早期基因BARF1、晚期基因BLLF1及BcLF1的表达状况；用免疫组化法检测未感染及感染细胞中细胞周期素cydinD1的表达.③结果 感染细胞及其克隆细胞形态由原来的梭形变为多形态,检测到EBNA1、BARF1及BcLF1的表达,未检测到EBNA2、BLLF1、LMP1及LMP2A的表达.感染EBV的GES-1细胞较未感染EBV的GES-1细胞的细胞周期素cyclinD1表达增高.④结论 EBV对GES-1细胞易感,并且EBV感染使得细胞周期素cyclinD1过表达.
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BARF1基因转染对人胃上皮细胞Bcl-2表达的影响
①目的 探讨EB病毒编码BARF1基因对人胃上皮细胞Bcl-2表达的影响.②方法 用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,G418筛选单克隆.用免疫组化法检测转染细胞及未转染细胞Bcl-2的表达状况.③结果 获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,转染BARF1基因的细胞Bcl-2表达显著高于未转染和转染空载体GES-1细胞(P＜0.01).④结论 BARF1基因可能上调了人胃上皮细胞Bcl-2表达.
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EB病毒感染人胃上皮细胞GES-1细胞株的建立与鉴定
①目的建立EB病毒感染的人胃上皮细胞细胞株,并进行鉴定.②方法将含有NEOr基因的重组EBV感染人胃上皮细胞GES-1,同时以pcDNA3(NEOr)空载体质粒经脂质体法转染同一细胞为对照,用有限稀释法进行克隆,经G418筛选,用免疫荧光组织化学法鉴定EBV编码的核抗原1(EBNA1)的表达情况,直至获得100%表达EBV的单克隆细胞株.③结果感染EBV的GES-1细胞大部分为EBNA1阳性,而转染pcDNA3(NEOr)空载体质粒的GES-1细胞均为EBV阴性.④结论成功地建立EB病毒感染的人胃上皮细胞GES-1细胞株,对EB病毒致胃癌机制的研究具有重要的意义.
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bcl-2基因转染对人胃上皮细胞GES-1细胞周期的影响
①目的 探讨bcl-2基因转染对人胃上皮细胞GES-1细胞周期的影响.②方法 采用携带新霉素抗性(NEOr)基因的pcD-NA3/bcl-2和脂质体(lipofectamine)法转染人胃上皮细胞系GES-1,同时以pcDNA3(NEOr)空载体质粒转染同一细胞作为对照,用新霉素418(G418)筛选出bcl-2转染的阳性克隆.流式细胞术检测各组细胞细胞周期.③结果 bcl-2基因转染组S期细胞数明显较对照组增多.④结论 bcl-2基因转染可使S期细胞增多,提高转染细胞的增殖能力.
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071幽门螺杆菌细胞空泡毒素在小鼠感染模型中的作用
幽门螺杆菌(Hp)分泌的细胞空泡毒素(VacA)是.Hp的一种重要毒力因子,但VacA参与Hp感染和致病的机制仍然不清楚.尽管可以观察到Hp感染后人胃上皮细胞和鼠胃上皮细胞发生的损害,但vacA基因变异的Hp菌株也可以引起限菌小猪和蒙古鼠发生相同的胃炎病变,似乎提示VacA不是毒力因子,这同流行病学及其他相关资料是矛盾的.
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携带BARF1基因的人胃上皮细胞株的建立
目的 建立携带BARF1基因的人胃上皮细胞株,为探讨EB病毒编码BARF1基因对胃上皮细胞的影响而建立体外模型.方法 构建携带BARF1基因的真核载体pcDNA3.1(+)-his/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,G418筛选单克隆.用CCK-8检测未转染的GES-1、转染空载体GES-1及转染BARF1基因的GES-1增殖状况.结果 双酶切鉴定,666bp的BARF1基因片段已连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his.转染细胞通过G418筛选,获得了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,转染BARF1基因的GES-1细胞增殖速度显著高于未转染的GES-1和转染空载体GES-1细胞(P＜0.01).结论 建立了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株.
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汉坦病毒激发人胃上皮细胞病变和凋亡
目的证实人胃粘膜上皮细胞是否为汉坦病毒属(HV)汉滩病毒型(HTN)和汉城病毒型(SEO)病毒的靶细胞,病毒对其是否有致细胞病变效应(CPE)和促凋亡作用.方法建立人胃上皮细胞(HGEC)离体培养;用HV N8、76-118、Z37、Seoul 8039株感染HGEC,观察细胞CPE,用直接免疫荧光法(IFA)检测病毒感染细胞和感染灶;用Annexin V-FITC kit观察HV的致HGEC凋亡和坏死作用.结果 HTNV和SEOV可以感染离体培养的HGEC,形成感染灶并出现CPE;与模拟感染细胞相比,N8、76-118、Z37、Seoul 8039株感染的HGEC凋亡和坏死细胞比例明显增高,HTNV较SEOV促凋亡和坏死作用更强.结论 HGEC可作为HTNV和SEOV感染的靶细胞,致CPE并促进细胞凋亡和坏死,在急性肾综合征出血热病人胃粘膜损害机制中起重要作用.
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乙醇诱导人胃上皮细胞株凋亡的研究
目的 探讨建立乙醇诱导人胃上皮细胞株(GES-1)凋亡模型的方法和可行性.方法 采用罗氏细胞实时动态分析仪、MTT比色法、Hoechst染色法、Annexin V-FITC/PI凋亡流式检测研究不同浓度的乙醇对人胃上皮细胞株(GES-1)凋亡作用.结果 (1)当乙醇浓度大于0.5 mol· L-1时,对GES-1细胞株有明显的诱导凋亡作用,而考察的TNF-α(100,50 ng·mL-1)则没有明显的细胞凋亡诱导作用;(2)通过形态学观察,发现乙醇模型组GES-1细胞株出现明显的凋亡细胞形态学改变;(3)Annexin V-FITC/PI凋亡流式分析结果发现乙醇浓度大于0.2 mol· L-1对细胞具有明显的诱导凋亡作用,乙醇主要诱导GES-1细胞株进入早期凋亡,且具有浓度依赖性,但该诱导作用具有时效性,在作用持续60 min后,其诱导作用会逐渐减弱.结论 乙醇对GES-1细胞株具有明显的诱导细胞凋亡作用,且具有浓度依赖性及时效性;本凋亡模型具有较好的重现性.
