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左金方和5-FU对胃癌细胞生长及BAX/Bcl-2表达的调控研究
目的:研究左金方和5-FU单独与联合对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的影响及对BAX/Bel-2蛋白表达水平的改变.方法:将不同浓度的左金方、5-FU及两药联合作用于体外培养的人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MGC803,Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测细胞增殖率的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测bel-2、bax蛋白表达.结果:1.00 ug·mL-1左金方、50.00、100.00 ug· mL-1 5-FU作用GES-1细胞24 h后,细胞存活率分别为(107.54±2.25)％、(53.67±1.91)％和(47.43±1.35)％,作用MGC803细胞24 h后,细胞凋亡率分别为(45.46±1.66)％、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)％;左金方联合5-FU (1.00+50.00)、左金方联合5-FU (1.00 +100.00)作用GES-1细胞24 h后,细胞存活率分别为(81.66±2.22)％和(78.68±2.10)％,作用MGC803细胞24 h后,相应的凋亡率为(61.30±1.71)％和(71.30±1.79)％,与单独用药比较差异有统计学意义.Western Blot凝胶电泳图可以看出,左金方联合5-FU (1.00+50.00)、左金方联合5-FU(1.00+ 100.00)作用MGC803细胞24 h后,进一步促进Bax的表达,降低Bel-2的表达,与各单独用药组比较差异有统计学意义.结论:左金方与5-FU联合用药有大幅降低5-FU细胞毒性作用,显著提高人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的存活率;通过促进MGC803细胞中Bax蛋白的高表达和Bel-2的低表达,促进人胃癌细胞的凋亡.
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EBV感染人胃上皮细胞GES-1中c-myc基因的表达
目的 研究Epstein-Barr virus(EBV)感染的人胃上皮细胞系GES-1 c-myc基因表达状况,探讨c-myc基因在EBV相关胃癌发生中的作用. 方法 采用携带新霉素抗性(NEOr)基因的重组EBV 产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,经有限稀释法克隆和G418筛选获得感染和转染细胞克隆,用pcDNA3空载体质粒转染的人胃上皮细胞系GES-1细胞作对照,采用免疫细胞化学染色(ICC)法测定EBNA1和c-myc蛋白以鉴定EBV感染细胞克隆及c-myc基因的表达. 结果 EBV感染的细胞克隆经Icc法检测EBNAI阳性,c-myc蛋白阳性;对照细胞均为阴性. 结论 EBV感染可使人胃上皮细胞c-myc蛋白表达增高,EBV对人胃上皮细胞的转化作用可能与c-myc基因的过度表达有关.
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幽门螺杆菌致胃上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株SGC-7901的氧化性损伤
目的: 探讨H pylori对人正常胃黏膜上皮细胞永生细胞株GES-1和人淋巴结转移胃腺癌细胞株SGC-7901的氧化性DNA损伤作用.方法: 采用细菌-细胞共培养的方法, 比较H pylori作用前后GES-1和SGC-7901细胞株的形态学变化;采用激光扫描共聚焦显微镜方法, 比较H pylori作用前后GES-1和SGC-7901细胞株8-羟基脱氧鸟苷(8-OhdG)的表达.结果: H pylori对GES-1和SGC-7901细胞株均具有损伤作用;8-OHdG表达升高, 加菌组与对照组相比差别具有统计学意义(64.9396±17.8142 vs 32.3010±7.3620;102.8344±30.2632 vs 77.1336±32.3223, 均P = 0.000);而且8-OHdG表达的变化程度GES-1细胞显著高于SGC-7901细胞.结论: H pylori能够诱导GES-1和SGC-7901细胞DNA氧化性损伤显著增加;在H pylori氧化损伤的相关研究中, 更适宜选择对损伤作用敏感的GES-1细胞株作为研究对象.
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研究MNNG诱导GES-1发生恶性转化后PTEN蛋白的变化意义
目的 观察MC细胞PTEN蛋白异常表达,探讨其在胃癌演进中的作用.方法 采用免疫组化检测GES-1永生化细胞和MC细胞PTEN蛋白表达.结果 MC细胞中PTEN蛋白表达明显低于GES-1细胞,x2=898.794,P＜0.001.结论 PTEN蛋白在MC细胞中表达下降,PTEN蛋白的表达异常在胃癌发生过程中具有重要意义.
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bcl-2基因转染对人胃上皮细胞GES-1细胞周期的影响
①目的 探讨bcl-2基因转染对人胃上皮细胞GES-1细胞周期的影响.②方法 采用携带新霉素抗性(NEOr)基因的pcD-NA3/bcl-2和脂质体(lipofectamine)法转染人胃上皮细胞系GES-1,同时以pcDNA3(NEOr)空载体质粒转染同一细胞作为对照,用新霉素418(G418)筛选出bcl-2转染的阳性克隆.流式细胞术检测各组细胞细胞周期.③结果 bcl-2基因转染组S期细胞数明显较对照组增多.④结论 bcl-2基因转染可使S期细胞增多,提高转染细胞的增殖能力.
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表达硫氧还蛋白1的幽门螺杆菌对人胃上皮细胞株GES-1生长的影响
背景:幽门螺杆菌(Hp)感染在胃癌的发生过程中发挥重要作用,细菌毒力因子是导致不同胃疾病的重要因素.目的:研究高、低表达硫氧还蛋白1(Trx1)的Hp对人胃上皮细胞株GES-1生长的作用.方法:按1∶50、1∶100、1∶200的细胞/细菌比例分别加入GES-1细胞和高、低表达Trx1的Hp菌株共培养,并设不加菌株的空白细胞作为对照组,分别于培养24h和48 h时采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞存活率.收集1∶100浓度组和对照组GES-1细胞,采用流式细胞术检测细胞周期.结果:高、低表达Trx1的Hp对GES-1细胞有损伤作用,细胞存活率降低,且呈时间和浓度依赖性,在Trx1高表达组中尤为明显.流式细胞术显示Trx1高表达组GES-1细胞进入S期的比例在24h和48 h均明显高于Trx1低表达组.结论:高、低表达Trx1的Hp对GES-1细胞生长具有抑制作用,高表达Trx1的Hp具有更强的致病性,与致胃癌作用有关.
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Trop2过表达对人胃黏膜上皮细胞GES-1迁移能力的影响及机制
目的:观察Trop2过表达对人胃黏膜上皮细胞GES-1迁移能力的影响,并对其作用机制进行初步探讨.方法:realtime PCR和Western blot检测GES-1细胞中Trop2 mRNA和蛋白的表达水平;构建过表达Trop2质粒及空载对照质粒并转染GES-1细胞,检测转染效率;细胞划痕实验和TransweU迁移实验检测过表达Trop2后GES-1细胞迁移能力的变化情况;Western blot检测过表达Trop2后GES-1细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子[上皮细胞标志E-钙黏附蛋白(E-cadherin),间皮细胞标志纤维连接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)]的变化情况.结果:相比胃癌细胞株BGC823和MGC803,Trop2在GES-1细胞中的mRNA和蛋白表达水平均较低;过表达Trop2的质粒转染GES-1后,Trop2的mRNA表达水平与未转染组相比提高(6.18±0.52)倍,而空载对照组和未转染组相比无明显变化,蛋白水平的变化情况和mRNA相似;细胞划痕实验表明,转染72 h后,过表达组细胞迁移率达到95％,空载对照组细胞迁移率为50％,两组相比差异有统计学意义(P＜ 0.05);Transwell迁移实验发现,转染24h后,过表达组穿膜细胞数为(87±6)个,而空载对照组为(41±6)个,两组相比差异有统计学意义(P＜ 0.05);Western blot检测过表达rrop2后,随着Trop2蛋白表达量增高,GES-1细胞E-cadherin表达下调,fibronectin和vimentin表达上调.结论:Trop2过表达可以提高胃黏膜上皮细胞的迁移能力,其机制与TroF2促进胃黏膜上皮细胞EMT有关.
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腹水草对人胃上皮细胞GES-1的保护作用及其对PKA、CREB、AQP1的调控研究
[目的]研究腹水草（Veronicastrum axillare，V. axillare）含药血清对乙醇损伤的人胃上皮细胞（gastric epithelial cells-1，GES-1）的保护作用及其对环腺苷酸依赖性激酶（protein kinase A，PKA）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）、水通道蛋白1（aqua-porin 1，AQP1）表达水平的调控作用。[方法]20只雄性SD大鼠随机分为5组（n=4），连续灌胃给药14d，制备正常组（生理盐水20 mL·kg-1）、雷尼替丁组（0.027g·kg-1）以及V. axillare低、中、高剂量组（0.7、1.4、2.8 g·kg-1）含药血清。MTT法检测体外培养的GES-1细胞的活性，研究V. axillare含药血清及PKA抑制剂H-89（25μmol·mL-1）预处理对5%乙醇诱导GES-1细胞活力的影响。荧光定量RT-PCR检测PKA、CREB及AQP1 mRNA的表达水平，Western blot检测AQP1蛋白表达水平。[结果]模型组和H-89组GES-1细胞活性低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；乙醇造模处理显著上调PKA、CREB及下调AQP1的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.01）；H-89处理显著抑制PKA和CREB mRNA表达水平（P＜0.01）；加入各剂量V. axillare含药血清不能显著改善H-89对PKA、CREB和AQP1 mRNA表达水平的抑制作用。V. axillare中、高剂量含药血清细胞活性高于模型组，PKA、CREB mRNA表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），而V. axillare中、低剂量含药血清AQP1表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。[结论]V. axillare含药血清显著减轻乙醇对GES-1细胞的损伤，对GES-1细胞具有保护作用，其保护机制与下调PKA、CREB及上调AQP1的表达有关。
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用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响
目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.
关键词： KLF4 CRISPR/Cas9 胃癌 GES-1 -
干扰PTEN基因表达影响人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1增殖和凋亡
目的:探讨PTEN对体外培养的人胃黏膜上皮细胞系GES-1增殖凋亡的影响及其磷酸化通路研究.方法:体外培养GES-1细胞,构建针对PTEN基因的shRNA慢病毒载体,感染GES-1细胞系,干扰PTEN的表达,实验分为空白对照组、慢病毒阴性对照组和干扰PTEN实验组;荧光显微镜、实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测其感染效率;CCK8测定GES-1细胞的增殖,流式细胞术测定细胞的周期和凋亡;实时荧光定量PCR检测GES-1的PTEN、Akt、ERK的mRNA表达水平;Western blot检测GES-1的Akt和磷酸化Akt(p-Akt),ERK 1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达.结果:干扰PTEN的慢病毒成功感染GES-1,降低了PTEN基因的转录和翻译水平.与空白对照组相比,PTEN表达降低后使G0/G1期的细胞比率减低,而G2/M和S期细胞比率增高,同时凋亡细胞减少,促进GES-1的增殖而抑制其凋亡.p-Akt和p-ERK1/2表达显著上调(P＜0.05),而对GES-1的Akt和ERK的mRNA及总蛋白表达没有影响(P＞0.05).结论:抑癌基因PTEN可以通过促进Akt和ERK的磷酸化,调节GES-1细胞下游的相关凋亡和信号通路,进而调节GES-1的增殖和凋亡.
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从形态及功能研究MNNG诱导GES-1永生化细胞的恶性转化
目的 探讨甲基硝基亚硝基胍(methyl nitro nitrosoguanidine,MNNG)作用于GES-1永生化细胞所发生的恶性转化.方法 MNNG作用于GES-1永生化细胞24 h后,通过显微镜和软琼脂集落形成实验观察细胞形态学、染色体变化和集落形成情况.统计采用t检验.结果 经MNNG处理的GES-1细胞(命名为MC)核增大,畸形,核染色质变粗,核仁肥大,核分裂.染色体可见双倍及多倍体,染色体断裂.克隆形成实验可见细胞接触抑制消失克隆形成,t=5.139,P＜0.05.结论 经MNNG诱导的GES -1细胞的生长特性改变,呈现肿瘤细胞的形态学及生长特征.
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EB病毒转化人胃上皮细胞GES-1中bcl-2基因的表达
目的 研究EBV感染人胃上皮细胞系GES-1后bcl-2基因的表达状况,探讨6cl-2基因在EBV相关胃癌发生中所起的作用.方法 采用携带新霉素抗性(NEOr)基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,经有限稀释法克隆和G418筛选获得感染和转染细胞克隆,用pcDNA3空载体质粒转染的人胃上皮细胞系GES-1细胞作对照:采用免疫细胞化学染色(ICC)法测定EBNA1基因的表达以鉴定EBV感染细胞克隆及测定EBV感染细胞中Bcl-2蛋白的表达.结果 与对照相比较,感染细胞中Bcl-2蛋白的表达阳性.结论 EBV感染可使人胃上皮细胞Bcl-2蛋白表达增高,EBv对人胃上皮细胞的转化作用可能与bcl-2基因的过度表达有关.
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Wnt5a在胃癌的表达及其临床意义
目的：观察Wnt5a在胃癌中的表达及意义。方法：采用RT-PCR法检测Wnt5a基因在正常胃黏膜细胞GES-1及胃腺癌细胞SGC7901中的表达；应用Western-blot法测定GES-1细胞及SGC7901细胞Wnt5a蛋白的表达；运用免疫组化SP法观察60例胃腺癌及30例癌旁胃黏膜组织Wnt5a蛋白的表达，分析Wnt5a表达与胃癌临床病理参数间的关系。结果：Wnt5a基因与蛋白在SGC7901细胞中的表达高于GES-1细胞；Wnt5a在胃癌组织中的表达高于癌旁正常胃黏膜组织（P＜0．05）。淋巴结转移及TNM分期越晚的胃癌组织Wnt5a表达越高（P＜0．05）。结论：Wnt5a与胃癌的侵袭和转移有关，在胃癌的发生发展中起癌基因样作用。
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MS-275通过上调ROS释放选择性杀伤胃癌细胞
目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275通过线粒体凋亡途径，选择性杀伤胃癌细胞的具体作用机制。方法：MS-275分别处理GES-1、MKN-45细胞，通过WST-1法检测细胞存活率，分析MS-275细胞毒性及选择性杀伤作用；通过流式细胞术检测线粒体膜电位变化，及ROS抑制剂对MS-275凋亡诱导作用的影响；Western blot、PCR分别检测处理后胃癌细胞中p21、p57、cyclin D1、cyclin E1、和TBP-2的mRNA及蛋白水平表达情况。结果：MS -275对正常胃黏膜上皮细胞GES -1存活率无显著性影响，但对胃癌细胞MKN-45影响显著（P＜0．05）。MS-275对胃癌细胞MKN-45线粒体膜电位影响不显著，但能够诱导ROS显著升高，ROS抑制剂显著降低由MS-275诱导的ROS释放。MS-275显著激活肿瘤抑制基因p21、p57、TBP-2以及细胞周期蛋白相关基因cyclin D1、cyclin E1的表达。结论：MS-275通过促进细胞周期阻滞因子、凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因的表达，诱导ROS生成，选择性杀伤胃癌细胞。
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bcl-2基因转染对人胃上皮细胞GES-1增殖的影响
目的:观察bcl-2基因脂质体法转染人胃上皮细胞系GES-1及其转染后对GES-1细胞增殖的影响. 方法:以脂质体法转染构成bcl-2基因表达的人胃上皮细胞系GES-1细胞模型,空载体质粒pcDNA3转染GES-1细胞及正常GES-1细胞为对照;经酶标免疫组织化学法鉴定bcl-2基因表达阳性细胞;用HE染色法进行形态学观察;并采用细胞计数及MTT法分析bcl-2转染后对GES-1细胞增殖的影响. 结果:脂质体法转染bcl-2基因后,细胞高表达Bcl-2蛋白;HE染色后形态学观察无明显改变;细胞计数法绘制细胞生长曲线结果显示bcl-2基因转染6 d后细胞生长速度明显超过对照组,MTT法结果显示bcl-2基因转染第24,48,72 h, A490 nm值分别为4.15±0.31,5.98±0.56,8.94±0.79,对照组分别为3.01±0.20,4.76±0.52,7.69±0.84,两组相比较具有显著性差异(P＜0.05). 结论:bcl-2基因转染使GES-1细胞稳定且高表达Bcl-2蛋白,并促进了细胞增殖.
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EB病毒感染对人胃上皮细胞GES-1增殖的影响
目的:探讨EB病毒感染人胃上皮细胞GES-1后对GES-1增殖的影响.方法:用携带新霉素抗性(NEOr)基因的重组EBV以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,同时以正常人胃上皮细胞GES-1为对照.经G418筛选出EBV感染阳性克隆,进行细胞形态学检测,并采用免疫组织化学染色法测定EBNA1的表达以鉴定EBV感染细胞克隆.对上述细胞用细胞计数法及MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术对细胞周期进行分析.结果:感染EBV的GES-1细胞大部分为EBNA1表达阳性,通过G418筛选,获得了稳定的EBV感染细胞克隆.EBV感染组细胞体积变大,核浆比增加.细胞计数法及MTT法绘制细胞生长曲线显示细胞增殖速度明显加快.流式细胞分析结果显示EBV感染组细胞S期延长.结论:EBV感染后使GES-1细胞稳定且高表达EBNA1,并且能够促进GES-1细胞的增殖.
