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去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨、肾、下丘脑中Smurf1信号转导蛋白的活性变化研究
目的:观察去卵巢骨质疏松症(OP)模型大鼠股骨、肾、下丘脑中Smurf1在细胞中的定位和活性变化,探讨肾虚OP病机的分子生物学机制.方法:实验采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法复制肾虚OP模型,同时应用纳米钙补肾中药低、高剂量,对模型大鼠灌胃干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力、补中益气汤干预模型大鼠作为阳性对照组,以及正常组、假手术对照组和模型组;免疫组化SABC法检测股骨、肾、下丘脑中的Smurf1蛋白活性表达.结果:Smurf1在股骨中的表达结果:与正常组比较,模型组表达显著下降(P＜0.01);与模型组比较,各用药组可上调其表达,其中补肾中药低、高剂量组、补中益气汤组有显著差异(P＜0.01).在肾中表达的结果:与正常组比较,模型组表达显著下降(P＜0.01);与模型组比较,各用药组均可上调其表达情况(P＜0.01).在下丘脑中的表达结果:与正常组比较,模型组表达显著升高(P＜0.01);与模型组比较,各用药组均可下调其表达情况(P＜0.01).结论:肾虚OP模型大鼠股骨、肾中Smurf1的表达降低,下丘脑中表达水平升高,可能是肾虚OP发生的机制之一.纳米钙补肾中药可能通过改善和调控股骨、肾、下丘脑中Smurf1表达,而起到防治原发性OP的作用.
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补肾填精中药对骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1信号转导蛋白表达影响的实验研究
目的 通过观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1 的表达变化,探索骨质疏松症的发病机理.方法 实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,同时应用补肾填精作用的纳米钙补肾填精中药低、高剂量组,对模型大鼠给药干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力作为阳性对照组,以及正常对照组、假手术对照组和模型空白组,并与补脾中药补中益气汤作比较;免疫组化SABC法检测股骨中的Smurf1 蛋白活性表达.结果 与正常组相比较,模空组Smurf1 阳性表达显著下降,P<0.01;用药12周后,与模空组相比较,各用药组均可上调其表达情况,P<0.01.结论 骨组织中Smurf1阳性表达降低可能是骨质疏松症发生的机制之一,补肾填精中药可能通过改善和调控股骨中Smurf1的表达,而起到防治骨质疏松症的作用.
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泛素连接酶Smurf1促进Smurf2的Nedd化修饰
目的 探讨泛素连接酶Smad泛素化相关因子2(Smad ubiquitination-related factor 2,Smurf2)Nedd化修饰的机制.方法 梯度过表达Nedd8检测Smurf2的蛋白水平变化,免疫共沉淀(IP)和Western印迹分析Smurf2的Nedd化修饰,GST融合蛋白沉降技术(GST-pulldown)验证相互作用,分析Smurf1 C426A基因敲入(knock in)小鼠体内Smurf2在淋巴、脾、肝和肺组织的蛋白表达水平.结果 Smurf2可发生Nedd化修饰,过表达Nedd8可导致Smurf2蛋白水平下调,Smurf1和Smurf2能相互作用,且Smurf1可使Smurf2的Nedd化修饰增强.在Smurf1 C426A基因敲入小鼠的组织细胞中Smurf2蛋白水平上调.结论 Smurf1能促进Smurf2的Nedd化修饰.
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泛素连接酶Smurf1促进PDK1的多聚泛素化修饰
目的 探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)发生多聚泛素化修饰的机制.方法 免疫共沉淀(CO-IP)和免疫印迹(WB)分析PDK1的多聚泛素化修饰,MEF细胞内印证泛素连接酶Smad泛素化修饰调节因子1 (Smurf1)增强PDK1多聚泛素化修饰,定点突变和CO-IP及WB确定PDK1多聚泛素化修饰位点.结果 PDK1可发生多聚泛素化修饰,泛素连接酶Smurf1增强PDK1多聚泛素化修饰,且依赖HECT类泛素连接酶Smurf1 K699位点活性;K304是PDK1多聚泛素化修饰位点.结论 泛素连接酶Smurf1增强PDK1的多聚泛素化修饰.
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慢病毒介导稳定敲低Smurf1细胞株的构建及对细胞迁移的影响
目的 构建慢病毒介导稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株并检测敲低Smurf1细胞迁移的影响.方法 将包装好的Smurf1敲低慢病毒感染HeLa和A549细胞,7 d后进行嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞,Western blot和qPCR检测敲低效果,并进行Transwell检测Smurf1敲低对细胞迁移的影响.结果 利用干扰慢病毒系统成功构建稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株,稳定敲低Smurf1抑制细胞的迁移速率.结论 敲低Smurf1抑制细胞迁移.
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Smurf1基因靶向RNAi慢病毒载体的构建及转染
目的 构建Smad泛素调节因子1(Smurf1)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础.方法 构建Smurf1基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4条RNAi片段并构建RNAi慢病毒载体.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western印迹法进行外源筛靶,筛靶出成功的干扰质粒PSC2939.用慢病毒包装PSC2939后感染U20S细胞,进行内源验证,荧光定量PCR和Western印迹检测U20S细胞中Smurf1 mRNA及蛋白的表达.结果 经PCR及测序证实,Smurf1基因过表达载体及4种干扰载体均成功构建；Western印迹外源筛靶显示,PSC2939干扰载体能有效敲减目的基因的表达；慢病毒包装后的PSC2939干扰载体能有效抑制U20S细胞中Smurf1蛋白的表达,对Smurf1 mRNA的抑制率达到60%以上.结论 成功构建可供感染的Smurf1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Smurf1基因在骨肉瘤细胞中的作用提供了有效的实验工具.
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Smurf1调节因子在骨形态发生蛋白诱导骨生成中的作用
骨形态发生蛋白(BMP)是明确具有诱导成骨作用的生长因子.其通过结合靶细胞表面受体,活化细胞内一系列Smad蛋白,经Smad蛋白介导,将信号转导至细胞核内,在一系列辅助因子的作用下,启动成骨基因的表达.细胞内源性Smurf1对这一整个过程起抑制作用.本文就Smurf1调节因子在骨形态发生蛋白诱导骨生成中的作用做一综述.
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SMURF1 、RUNX3在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义
目的 探讨SMURF1、RUNX3蛋白在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及其与患者临床病理特征的相关性.方法 采用免疫组化SP法检测60例PTC组织及20例正常甲状腺组织中SMURF1、RUNX3蛋白的表达,分析两者在PTC与正常甲状腺组织中的表达差异及其与PTC患者临床病理特征的相关性.结果 PTC组织中SMURF1蛋白阳性表达率高于正常甲状腺组织,而RUNX3阳性表达率低于正常甲状腺组织(均P＜0.01);SMURF1、RUNX3蛋白的表达与PTC患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移均相关(均P＜0.05),而与患者性别、年龄及肿瘤大小等因素均无关(均P＞0.05).PTC组织中SMURF1的蛋白表达与RUNX3蛋白表达呈负相关(r=-0.564,P＜0.05).结论 SMURF1、RUNX3蛋白在PTC组织中表达异常,并呈负相关,提示两者可能相互作用,共同促进PTC发生、发展,两者可作为PTC分类和分期的辅助指标.
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脂溢性角化病皮损区Smurf1和Smurf2表达增强
目的 探讨脂溢性角化病皮损区Smad泛素化调节因子1和2(Smad ubiquitination regulatory factor 1 and 2, Smurf1, 2)的表达及其意义.方法 采用实时定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time PCR,RT-PCR)和免疫组织化学技术分别检测脂溢性角化病皮损和对照正常皮肤中Smurf1和2的表达情况.结果 与对照正常皮肤相比,脂溢性角化病皮损中Smurf1和2表达水平上调.结论 脂溢性角化病皮损中Smurf1和2的过度表达可干扰转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号转导通路,可能使TGF-β抑制上皮增生的作用不能有效发挥,促进了脂溢性角化病表皮的过度增生.
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结肠癌组织中SMURF1蛋白的表达及意义
目的：分析结肠癌组织中SMURF1蛋白的异常表达及其意义。方法：应用免疫组化法检测40例结肠癌组织及癌旁正常组织的SMURF1蛋白表达情况，比较分析 SMURF1蛋白在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达差异及其临床病理意义。结果：SMURF1蛋白在癌组织中的表达显著高于癌旁组织（χ2=5.32， P<0.05）。结肠癌组织中SMURF1蛋白表达与肿瘤分化程度（P =0.008）、TNM分期（P =0.01）及淋巴结转移（P =0.01）显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤浸润深度及有无远处转移无明显相关。结论：SMURF1蛋白表达与结肠癌的分化程度及临床分期有一定相关性，可用于预测结肠癌的预后。
