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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因,并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列,并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,确定人的HCBP6基因由456 nt组成,编码152aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因,其中13条基因表达增强,7条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆蛋白结合蛋白的有效方法,基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白E-19的研究
目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为其与HBV引起免疫耐受、免疫系统功能障碍有关.筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接人酵母表达载体p GBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.并根据GenBank中的序列信息设计引物从并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀方法再次验证二者之间的结合作用.结果:成功克隆出HBeAg基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能使X-α-gal变成蓝色的真阳性菌落39个,其中有5个未知基因,在genbank中未找到同源序列,在HepG2细胞的mRNA中成功扩增出该基因的全序,体外免疫共沉淀方法证明HBeAg与新基因E-19表达的蛋白质在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBeAg的肝细胞结合蛋白,发现与HBeAg有相互作用的未知蛋白新基因,为HBeAg的功能研究提出新线索.
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双重质量控制在结核病患者血清抗体谱筛选血标本采集中的应用
目的:通过质量控制,提高标本采集质量,降低患者异常反应发生,保障检验结果的准确性.方法:对我院实施双重质量控制前后的血液标本进行分析,对比前后标本不合格率是否有明显差异,发生异常反应的患者人数是否有差异,分析差异是否有统计学意义.结果:实施双重质量控制前,患者异常反应为0.36%,标本不合格为0.37%;实施双重质量控制后,患者异常反应为0.15%,标本不合格为0.15%,P<0.05,差异有统计学意义.结论:只有实现护理质量的前馈控制和同期控制,才能提高标本采集的质量.
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组织芯片联合基因芯片在肿瘤研究中的应用
组织芯片是指固定在载玻片上的组织微点阵,可同时进行分析大量同一实验指标(DNA、RNA及蛋白质)的研究;基因芯片是指固相载体上的高密度DNA微点阵,可检测异常组织与正常组织差异表达基因.组织芯片与基因芯片配合使用在寻找肿瘤基因中有很好的互补作用.利用基因芯片检测出差异表达的候选肿瘤基因,然后,利用组织芯片迅速筛选鉴定肿瘤基因.从而大大简化和加快从基础研究到临床应用的进程.
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一株与中草药五倍子协同抑菌的芽孢杆菌筛选及体外益生效果评价
目的 利用分子生物学方法对从猪肠道食糜分离的芽孢杆菌进行鉴定,并通过体外法评价其益生效果.方法 实验从健康猪肠道食糜中筛选到l株能抑制大肠埃希菌、副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌生长,并与中草药五倍子具有协同抑菌作用的芽孢杆菌AP139.结果 经16S rDNA同源性序列分析,结合形态和生理生化特点,鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis).芽孢杆菌AP139联合中草药五倍子发酵结果表明:5%组对4种致病菌的抑菌圈直径分别扩大了1.20、14.45、23.54和6.09 mm,其抑菌效果优于未发酵,对巴氏杆菌PM2010和猪大肠埃希菌抑菌圈极显著提高(P<0.01),对金黄色葡萄球菌抑菌圈有显著提高(P<0.05).经体外益生效果评价得知,AP139菌株在pH=5.0~8.0的条件下活菌数均较高,NaC1浓度为1%时生长较好,0.3%胆盐和人工肠液分别处理3h后存活率分别达84.26%和89.35%.结论 芽孢杆菌AP139具有良好的协同抑菌作用,并具有益生菌的耐酸、耐胆盐、耐胃肠液等特性,可适应动物胃肠道内环境.
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新的肝脏特异性自身抗原的筛选、克隆、表达的研究
自身抗体特别是肝脏特异性自身抗体是自身免疫性肝病的主要特点,也是自身免疫性肝病的诊断和分型的主要标志.我们在2例高度怀疑自身免疫性肝病的患者血清中检测到一新的不明肝特异性自身抗体,应用表达性噬菌体文库筛选技术对未知自身抗原进行筛选鉴定,以期建立更为完善的自身抗体检测体系,进一步明确自身抗原在自身免疫性肝病发病机制中所起的作用.
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问号钩体黄疸出血群赖型赖株特异性基因的筛选
通过抑制消减杂交技术,比较问号钩体黄疸出血群赖型赖株与双曲钩端螺旋体57001株之间基因组的差异,筛选致病钩体特有的基因片段.主要方法为以问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株为tester,非致病性双曲钩端螺旋体57001株为driver,培养后分别抽提基因组DNA,经Alu Ⅰ酶切后连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR,获得的消减混合物经T/A克隆后,转化入pMD18中建立消减杂交文库.经PCR和dot blot筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及同源分析.结果显示在随机挑取的188个克隆中,有35个含有tester特异的DNA序列.特异性片段测序后进行生物信息学分析,发现.本研究筛选并分析了可能与钩体毒力相关的基因.为进一步探讨该基因地生物学功能及阐明问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株致病分子机制打下了基础.
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菊粉酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化
菊粉酶因其能水解菊粉中β-2,1-D果聚糖果糖苷键而广泛用于高果糖浆、低聚果糖和酒精的生产,在药品和食品工业生产中具有重要的应用价值和良好的应用前景。本文从菊芋根际土壤中筛选分离获得28株菊粉酶产生菌株,经进一步复筛获得一株产菊粉酶能力较高的菌株ni-3,在对其常规形态学及生理生化特性鉴定的基础上,对部分长度的16S rDNA 同源性进行了分析,发现 ni-3菌株与中孢短芽孢杆菌相似度达99.5%,命名为Brevibacillus centrosporus ZF-9。本文还对其发酵产酶培养基进行单因素试验及响应面优化,确定了 ZF-9佳产酶条件为:菊粉45g? L -1,酵母膏11 g? L -1,Na2HPO420 g? L-1,在该培养基下,菊粉酶活可达6.41 U? mL -1。
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家兔感染沙门氏菌和志贺氏菌后血清抗体水平变化研究
疾控机构承担着服务行业从业人员的健康查体,目前国家规定除一般检查及胸透外,还有肝功检查和伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌检查.对于沙门氏和志贺氏菌检验一般采用大便培养的办法检查其是否带菌,但从采便到培养筛选鉴定需要很长的时间,且由于大肠杆菌的干扰,乳糖发酵使分离平板基底变色,严重影响了沙门氏菌、志贺氏菌的筛选,很容易造成漏检,由于时间较长,也很难让查体者接受.本着方便查体者,节约时间,及时筛查出带菌者,山东省疾病预防控制中心于2010年6~8月采用了血清抗体测定法筛查查体者是否感染沙门氏菌、志贺氏菌,并对该方法进行了实验研究,现报告如下.
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赖型钩端螺旋体与非致病钩端螺旋体差异基因片段的筛选与鉴定
目的:利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),比较致病与非致病钩体之间基因组差异,筛选致病钩体特有的基因片段,以分析钩体毒力相关基因.方法:以赖型钩体017株为tester,非致病性patoc Ⅰ株为driver进行SSH.用3种四碱基内切酶RsaⅠ、HaeⅢ、AluⅠ分别酶切基因组DNA,选择适内切酶消化产物(小于2 kb的片段),连接特殊设计的Adaptor进行消减杂交的PCR,得到消减混合物,与T/A克隆载体连接,转化JM109建立差异消减文库,经PCR和Southern blotting筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和相似性分析.结果:AluⅠ适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段;经PCR和Southern blotting筛选鉴定得到25个致病钩体中特异存在的阳性克隆,阳性率达到62.5%;序列测定显示插入片段大小为149-1 506 bp,平均480 bp, GC含量从26.30%到51.98%不等,平均36.63%;相似性分析其中6个片段无任何相似性匹配,18个有一定相似性的序列可分为两类:与外膜蛋白或假想蛋白相关和与生化代谢修饰的酶相关.20个序列已被GeneBank收录,收录号分别为AF300873-AF300877,AF325807-AF325821.结论:SSH是一种有效、灵敏的、高特异的比较分析基因组差异的方法,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义;利用SSH技术筛选得到的致病钩体特有消减片段很可能与致病钩体的分子进化和毒力有关,也为我国特有微生物的基因资源开发和基因工程疫苗的设计提供给了重要信息.
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长非编码RNA MALAT1的研究进展
MALAT1基因(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1)即人肺腺癌转移相关转录本1基因,初是在研究人非小细胞肺癌的转移中通过减除杂交法筛选鉴定出的一个新的长非编码RNA,它是定位于人类11q13染色体上,长约8 700 bp的非编码RNA,缺乏有意义的开放性编码框,在体外无法翻译出相应的蛋白质.同时其在序列上存在着进化保守,种属间具有高度同源的序列,提示其在肿瘤的发生发展和转移的过程发挥着重要功能,现将近年来对其研究作一系统综述.