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RAD18基因在多种细胞及大鼠多种组织中的表达
RAD18基因是人类基因组计划研究的重要模式生物--啤酒酵母的复制后修复上位显性组的重要成员,其编码的产物RAD18蛋白与RAD6蛋白在体内形成紧密的复合物.鉴于DNA修复基因在进化上具有很强的保守性,为探讨RAD18基因在高等动物细胞中存在的意义,我们以全长的RAD18基因为探针,应用染色体原位杂交技术及RNA印迹技术对多种细胞如KGY444(裂殖酵母)、S2(果蝇)、NIH3T3(小鼠)、A10(大鼠)、COS-7(猴)、293(人)等及Wistar大鼠多种组织进行了研究.染色体原位杂交结果显示,上述各种细胞均有很强的RAD18基因杂交信号,而质粒载体片段杂交对照则无信号.RNA印迹杂交结果表明,上述各种细胞及Wistar大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等组织均有RAD18基因表达.这说明RAD18基因无论是在生物进化上,还是在维持细胞的正常功能方面均具有重要意义.本工作为今后克隆哺乳动物及人类该基因同源基因提供了理论依据.
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TopBP1在DNA损伤修复及乳腺癌发生中的作用
一、概 述人类DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(DNA to-poisomeraseⅡβ-binding protein 1,TopBP1)是初于1997年由Yamane等人经双杂交筛选分离得到的一种能结合到DNA拓扑异构酶Ⅱβ蛋白C末端区域的蛋白[1].TopBP1基因定位于人类染色体3q22.1,含29个外显子,编码的TopBP1蛋白含1522个氨基酸,分子质量180kDa.人类TopBP1蛋白的同系物包括爪蟾的Xcut5/Xmus101,果蝇的Mus101,线虫的MUS-101,拟南芥的Mei1,啤酒酵母的Dpb11,裂殖酵母的Cut5/Rad4等[2].
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂对裂殖酵母核基因SRK1和线粒体基因转录的影响
目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors)丙戊酸(valproic acid,VPA)对裂殖酵母体内应激激酶核基因SRK1和线粒体基因转录的影响.方法 在裂殖酵母972细胞中加入梯度稀释的VPA测定细胞生长曲线并计算半数抑菌浓度(IC50).检测分别加入1和5μmol/L VPA处理6h后,核基因SRK1的转录水平；检测同等处理条件下裂殖酵母体内线粒体基因的转录水平.结果 VPA对972细胞的IC50为7.57μmol/L.1 μmol/L VPA处理的细胞中核基因SRK1转录水平上调5.5倍,外加5 μmol/L VPA处理的细胞中SRK1基因转录水平上调4.2倍；经1μmol/L VPA处理后,线粒体基因COB,SPMIT2,SPMIT3上调倍数分别为3、4.59和6.31倍,其他基因变化不大,经5μmol/L VPA处理后,线粒体基因转录水平全部上调,上调范围2.63～7.02倍.结论 在裂殖酵母体内,VPA能通过抑制细胞内去乙酰化酶而调节细胞核基因和线粒体基因的转录水平,加入IC50水平的VPA引起与应激相关核基因SRK1的转录水平显著上升,且线粒体内大部分基因转录水平也随之升高,说明细胞受到刺激后核基因和线粒体基因均能通过调节转录水平来阻挡外界刺激对细胞的影响.
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蜂毒肽融合蛋白在裂殖酵母中的表达研究
将抗菌肽之一的蜂毒溶血肽(Melittin)基因序列定向克隆到表达载体pESP-2中,构建GST-Melittin融合蛋白.利用载体上严格受硫胺素浓度调控的启动子Pnmtl,采用先扩大培养后诱导表达的两步培养法,实现了融合蛋白在裂殖酵母Schizosaccharomyces Pombe中的异源表达.然后通过GST亲和层析法一步纯化得到融合肽.研究中1 L培养液收集到约5 g鲜活酵母菌.纯化得到400/μg融合蛋白,融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot验证,表明蜂毒肽融合蛋白已在裂殖酵母中高效的表达,并可以通过GST亲和层析法得到有效纯化.初步的活性实验证明所获得Melittin蛋白对Escherichia Coli DH5α菌种有良好的抑菌效果.
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死亡素突变体TH1在裂殖酵母中的分泌表达
通过PCR方法人工合成带有K28信号肽的死亡素突变体基因,构建了重组表达载体pRHZ-41-κ28Th1,转化到裂殖酵母中进行表达,发酵液中检测到与TH1理论分子量一致的多肽分子,微量稀释法检验表达产物具有抑菌活性,并计算了粗产物对4种供试菌的低抑菌浓度.
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重组死亡素裂殖酵母工程菌发酵的研究
在裂殖酵母基本培养基的基础上,通过正交设计,优化了培养基6个组分;优化后的培养基,摇瓶发酵,目的蛋白产量在26～51 mg/L之间,发酵罐的批次发酵,产量在51～102 mg/L之间.
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死亡素在裂殖酵母中的表达
目的:在裂殖酵母中表达死亡素.方法:通过PCR方法人工合成死亡素基因,构建重组表达载体pRHZ-41-Tha,转化到裂殖酵母中,杯碟法检验表达产物活性.结果:重组载体构建成功并且转化到酵母中,外源基因在转化子中得到了表达,表达产物具有抑菌活性.结论:本研究成功构建了具有抑菌活性的表达产物,为进一步将死亡素研制成添加剂和药物奠定了一定的基础.
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裂殖酵母复制检查点调控
细胞在繁殖时可能遇到各种各样的干扰,因此细胞需要用检查点时时监控基因组.当复制干扰发生时,复制检查点被激活并保证M期在S期完成后进行.检查点通过感受器,信号转导蛋白,效应器之间的一系列信号传导级联反应,作用于其终调控对象,并排除"故障".由于裂殖酵母同哺乳动物的检查点结构为相似,文章将详细论述裂殖酵母复制检查点调控过程及其与人类检查点的相似之处.
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TOPO克隆构建SARS-CoV M蛋白基因裂殖酵母表达载体及其稳定性
目的 利用TOPO克隆法构建SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母重组表达载体,并验证重组载体在宿主细胞中的稳定性.方法 运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从SARS-CoV RNA中扩增出M蛋白基因,AT克隆构建出序列正确的pMD18-T-M重组载体.设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-M载体上亚克隆出M蛋白基因,与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行TOPO克隆,构建出重组表达载体pNMT1-M,转化TOP10感受态细胞,菌落PCR鉴定阳性转化子后进行测序鉴定.将序列正确的pNMT1-M重组载体电转化入裂殖酵母TCP1菌株中,在EMM培养基中诱导表达,连续传代100代,在EMM+T培养基中验证其稳定性.结果 RT-PCR获得666 bp的片段,pMD18-T-M重组载体经测序验证序列正确;重组表达载体pNMT1-M经菌落PCR和测序鉴定均正确;重组裂殖酵母菌经诱导后,SDS-PAGE检测出了表达条带;重组表达载体连续传代后,未发现丢失现象.结论 成功地构建出了SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母表达载体,验证了其在裂殖酵母中能稳定地进行遗传,为下一步的表达优化、活性和功能研究垫定了基础.
关键词： TOPO克隆 SARS-CoVM蛋白基因 表达载体构建 裂殖酵母 -
细胞蛋白依赖性激酶10与病理性瘢痕
1970年,Paul Nurse等以裂殖酵母为实验材料,发现了许多细胞周期调控基因,如:裂殖酵母cdc2等.CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性,称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK),因此CDC2又被称为CDK1,激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应,如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失,将H1磷酸化导致染色体的凝缩等,这些效应的终结果是细胞周期的不断运行.因此,CDK激酶和其调节因子又被称作细胞周期引擎.目前发现的CDK在动物中有13种,各种CDK分子均含有一段相似的激酶结构域,这一区域有一段保守序列,即PSTAIRE,并根据这一保守域的序列而命名,其与细胞周期蛋白的结合有关[1].
