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SARS-CoVM蛋白基因文献资料
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TOPO克隆构建SARS-CoV M蛋白基因裂殖酵母表达载体及其稳定性
目的 利用TOPO克隆法构建SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母重组表达载体,并验证重组载体在宿主细胞中的稳定性.方法 运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从SARS-CoV RNA中扩增出M蛋白基因,AT克隆构建出序列正确的pMD18-T-M重组载体.设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-M载体上亚克隆出M蛋白基因,与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行TOPO克隆,构建出重组表达载体pNMT1-M,转化TOP10感受态细胞,菌落PCR鉴定阳性转化子后进行测序鉴定.将序列正确的pNMT1-M重组载体电转化入裂殖酵母TCP1菌株中,在EMM培养基中诱导表达,连续传代100代,在EMM+T培养基中验证其稳定性.结果 RT-PCR获得666 bp的片段,pMD18-T-M重组载体经测序验证序列正确;重组表达载体pNMT1-M经菌落PCR和测序鉴定均正确;重组裂殖酵母菌经诱导后,SDS-PAGE检测出了表达条带;重组表达载体连续传代后,未发现丢失现象.结论 成功地构建出了SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母表达载体,验证了其在裂殖酵母中能稳定地进行遗传,为下一步的表达优化、活性和功能研究垫定了基础.
关键词： TOPO克隆 SARS-CoVM蛋白基因 表达载体构建 裂殖酵母
