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人类神经丝蛋白基因hSTE的分子克隆
啤酒酵母是人类基因组计划的重要模式生物,它的全基因组测序已于两年前完成,其功能基因组研究亦已全面展开.到目前为止,在已知基因中约1/3功能已经清楚,余下2/3基因的功能有待进一步研究.在全基因组所有6 000多个基因中,约1/4的基因尚未被研究,其中一部分基因在功能上尚不能进行归类,称为"孤儿基因"(orphan genes).我们根据系统测序发现的新的开放阅读框基因STE编码的蛋白质序列,在Internet下进行Blast分析,搜寻到一个高分值的人EST,再根据获得的EST序列设计两条引物分别和人脑cDNA文库插入子两端的载体序列配对组成类似于5′-RACE和3′-RACE的扩增体系,获得5′端序列和3′端序列.完成测序后和人的EST库中相关EST进行比较分析,拼接出一个全长为3773bp的cDNA,其中长的开放阅读框在1～3078之间,编码的蛋白质含1026个氨基酸,并含有多个重复的KSP磷酸化位点.同源性检索发现它和人类神经丝蛋白H的同源性在90%以上.将克隆的该基因命名为hSTE并登录到Genbank,登记号为AF203032.利用模式生物对克隆的基因进行遗传互补测验的工作目前正在进行中.
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人DNA修复基因HR24L/HRAD17校正酵母细胞减数分裂缺陷表型
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA修复基因RAD24在进化上具有高度保守性, 非洲粟酒酵母(Schizosaccaromyces pombe)的同源物则是RAD17.我们分离了啤酒酵母RAD24基因温度敏感突变株rad24L,进而用遗传互补法克隆出人类同源基因HR24L (北京医科大学学报,1999,31:269) .继我们报道之后,美国哈佛大学学者通过分析基因组信息,比较与非洲粟酒酵母RAD17同源片段,利用PCR方法扩增出人类RAD17同源cDNA,然后筛选文库获得人类RAD17(HRAD17)基因(Cancer Research, 1999,59:2023-2028),序列测定结果表明与我们克隆的HR24L是同一个基因.该基因编码的产物不仅参与DNA损伤切除修复和重组修复,而且还参与细胞周期检定点调控.鉴于细胞周期检定点调控是体细胞进行有丝分裂(mitosis)和生殖细胞进行减数分裂(meiosis)共有的周期性事件,因此,我们用遗传学方法分离酵母细胞减数分裂突变株,用功能互补法研究人HR24L基因的互补作用.
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人DNA修复基因hR24L参与细胞周期检定点调控
目的:研究酵母RAD24L基因功能,克隆人类同源物.方法:分离RAD24基因区域rad24L突变株,以人的cDNA表达文库转化突变株,筛选回复表型;大剂量X线照射观察细胞周期.结果:rad24L对紫外线敏感,从转化文库后的回复表型中克隆出人类hR24L全长cDNA.结论:克隆的人类DNA修复基因hR24L,它能校正rad24L的突变表型,参与细胞周期检定点调控.
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pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用
目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC 155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补( BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用.方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆.利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pBiFC-VN173载体中.然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中.应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21 MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用.结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组栽体构建成功；基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9％.BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内.结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合.
