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皮肤经络的形态学基础及其立毛肌-交感轴突反射传递机制
我们把经络分为血管性与非血管性两大类,本文深入研究了非血管性经络--皮肤信息通路或皮肤交感神经敏感线的结构和活动机制.首先用宏观放射自显影的方法,在大鼠皮肤中显示出纵贯全身的系列交感物质分布线,连续清晰、左右对称,在头部和肢体末端形成环路.在沿物质分布线经过的背上部切断皮肤,可以显著阻断针刺"足三里"产生的针刺效应,说明皮肤的交感物质分布线即针刺信号传递线路,或者说,经络的形态学基础已经显现出来.进一步通过SPG荧光染色法观察到,位于大鼠皮肤的交感物质分布线来源于其下支配立毛肌的交感神经网络.结合我们过去关于拔除经线毛囊阻断针刺效应的实验,提出毛囊立毛肌在经络实质中的动力靶器官作用和实体形态学基础.后,为探索针刺信号的传递机制,将大鼠环形剪毛,针刺后出现与宏观显影线走行一致的立毛线或立毛带,表明交感物质分布线即立毛线.皮内注射苯肾上腺素或垂体后叶素后出现相似的立毛线;在去中枢神经支配的皮条上也观察到延伸至在体皮肤上的立毛线;全部切断皮肤阻断了立毛线的跨切口传递;仅切断部分真皮则没有影响,如果在切断部分真皮的切口内微量注射普鲁卡因同样可以阻断立毛线的跨切口传递.说明立毛线的产生是由于立毛肌收缩的机械牵拉及由之引起的局部真皮深层轴突反射传导介导,或者说针刺信号的传递机制为立毛肌机械牵拉-皮内交感神经轴突反射传递.后,将大鼠全身毛剃光后,首批生长出来的毛呈线状和环状,构成皮肤毛线环路系统,与交感物质分布线一致,且更加周全.本文为经络的形态学研究提供了依据.
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补肾中药对老年大鼠脑组织中胆碱能M受体分布的影响
采用受体放射配基结合分析、原位杂交和放射自显影术等方法,研究胆碱能M受体、M1受体mRNA在脑组织中的分布,观察补肾中药对胆碱能M受体的含量、功能及分布的影响,探讨补肾中药延缓脑组织衰老的机理.结果显示:老年大鼠大脑皮层、海马、纹状体中M受体明显减少,放射自显影的灰度值降低,胆碱能M1受体mRNA在老年大鼠纹状体部位的表达减少,在其他部位的不明显.补肾中药明显增加老年大鼠胆碱能M受体的数量,对脑内胆碱能M1受体mRNA转录水平降低的部位有改善作用.补肾中药可通过改善胆碱能M1受体的mRNA表达、增加脑内胆碱能M1受体数量来延缓脑组织衰老.
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自体成纤维细胞注射移植的存活性初探
为观察自体成纤维细胞移植后在体内成活和分泌胶原情况,体外培养兔自体成纤维细胞,部分细胞3H-TdR掺入,标记和未标记的8×1010L-1细胞悬液,分别注射于兔耳背侧真皮浅、深层交界处3次.5月后取材,进行放射自显影,H-E染色,天狼猩红染色观察,发现3H-TdR掺入标记的细胞依然存活;注射部位出现大量的幼稚型成纤维细胞;真皮厚度增加,实验组为140.26±6.31(×5μm),对照组为127.66±4.78(×5μm)(P＜0.01);Ⅲ型胶原含量增加,实验组为2.63±1.41(cm2),对照组为1.05±0.90(cm2)( P＜0.05).表明自体成纤维细胞注射移植后,能够在体内长期存活并分泌新生Ⅲ型胶原,为临床应用提供了初步、可靠的理论依据.
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7-硝基吲唑对大鼠大脑皮质离子型谷氨酸受体和GABAA受体的影响
目的探讨一氧化氮(NO)对大鼠脑皮质离子型谷氨酸受体(NMDA、AMPA、KA受体)和GABA受体的影响. 方法将Wistar大鼠腹腔注射神经细胞结构型一氧化氮合酶抑制剂7-硝基吲唑,以氚标配体分别标记NMDA、AMPA、KA和GABAA受体,用图像分析仪对大鼠额区、顶区、后肢区、梨状区、压部后区和味觉区皮质内标记受体进行定量分析. 结果实验组大鼠额区、后肢区和梨状区内NMDA、AMPA、KA受体和GABAA受体含量均显著增加;顶区皮质内NMDA、KA受体和GABAA受体增加显著;味觉区皮质内KA受体增加显著. 结论 NO可能参与大鼠脑皮质离子型谷氨酸受体和GABA受体水平的调节.
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小鼠2-细胞、4-细胞胚胎G1期检测及同步化的研究
目的研究小鼠2-细胞、4-细胞胚胎同步化的方法,并检测其G1期的持续时间.方法先用低温抑制和噻胺酯哒唑阻断的方法分别将小鼠2-细胞和4-细胞胚胎同步化于G1期,然后利用放射自显影技术检测胚胎DNA的合成.结果(1)小鼠2-细胞胚胎G1期的持续时间短于3h.(2)噻胺酯哒唑对胚胎细胞的抑制作用及对胚胎发育的影响有浓度依赖性.(3)小鼠4-细胞胚胎的G1期约3～4h.结论小鼠早期胚胎细胞周期的G1期持续时间都很短,利用噻胺酯哒唑阻断和低温控制的方法能够得到大量同步于G1期的胚胎细胞.
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HCV准种的结构蛋白在真核表达系统中的表达
本实验从1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的8个C/E1/E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI-neo,并转染大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序,构建为插入C/E1/E2的重组质粒.将1μg重组质粒、0.36 mCi/ml H3-亮氨酸加入TNT/T7 Couple Reticulocyte Lysate Systems (含有25μl TNT Lysate、4U T7 RNA聚合酶、20μmol/L不含亮氨酸的氨基酸混合物、40U RNA酶抑制剂),总反应体积50μl.取5μl反应液进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,抽干凝胶,-70℃放射自显影3 d.
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肝细胞生成素核受体的确定及特性
目的:肝细胞生成素(HPO)特异性刺激肝细胞增生的信号转导存在特异性核受体信号转导途径.方法:利用125I标记的HPO,通过受体结合和特异性竞争抑制实验及Scatchard分析原代培养大鼠肝细胞和肝癌细胞核抽提物中核受体.结果:原代培养大鼠肝细胞和肝癌细胞核抽提物中存在核受体,核受体数量分别为1.7×109/g、和5.0×109/g,平衡解离常数(Kd)分别为35 pmol及1 2 pmol,且存在数量上和亲和力的差异,此结合不能被EGF、生长激素和甲状腺激素所竞争抑制.HepG2细胞放射自显影显示HPO核受体的存在.结论:HPO促肝细胞增生作用可以通过肝细胞核受体介导.
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正常与硬化肝组织基因表达差异的初步分析
目的:了解肝硬化的基因表达概况,寻找在肝硬化及正常肝组织中差异表达基因.方法:以各24例肝硬化及正常肝组织的总RNA混合定量后反转录合成含有α-32P dATP的cDNA为探针,与Atlas微阵列表达分析膜杂交.结果:放射自显影结果经AtlasImageTM软件分析显示:在所分析的588种已知基因中,Integrin beta 7、collagen type XVⅢ等17个基因在肝硬化组织中表达上调,TFDP2、BAK、ABL等98个表达下调,参与细胞增生、凋亡、分化、细胞间相互作用、与细胞侵袭相关的基因表达水平发生了明显改变.结论:通过Atlas微阵列系统分析发现的这些基因的表达改变组成了一个肝硬化特异的基因表达谱.系统地研究肝硬化的基因表达改变,与肝硬化发生相关基因的差异变化可为肝硬化诊断和治疗提供线索.
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糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞信号转导物DAG的影响
近年来,有关细胞内信号转导与细胞功能的研究越来越引起人们的关注,二酰基甘油是细胞内重要的信号转导系统[1].本研究采用薄层层析、放射自显影和放射标记方法检测糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞信号转导物DAG含量影响以及抗氧化剂VitE的干预保护作用,以期揭示糖尿病病人发生微血管病变的分子机制和预防措施.
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雷公藤抑制致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达及GATA3活性
通过对致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达和GATA3活性的观察，探讨雷公藤内酯醇（TP）对IL-5基因转录水平的调节机制，并与地塞米松（DM）的作用比较。 材料与方法（1）动物模型建立及分组：BALB/c小鼠24只，随机平均分为4组：正常对照组，以生理盐水代替卵蛋白（OVA）致敏和激发；致敏组，以OVA致敏和激发［1］；TP组，每次激发前1 h腹腔注射TP 40 μg/kg体重；DM组，每次激发前1 h腹腔注射DM 10 mg/kg体重。TP组与DM组后一次激发后24 h再给药1次。（2）原位杂交（ISH）：制备脾脏T细胞涂片。IL-5寡核苷酸探针序列：5′TCT CAA AGA ACC ACA TTA CTT GTG GCT CAC 3′。随机观察200个细胞，计数杂交阳性T细胞数。（3）凝胶电泳迁移率实验（EMSA）：BALB/c小鼠30只，随机分为正常对照组（5只）和致敏组（25只），致敏方法同上。Panning法［2］分离CD+4T细胞，用丝裂霉素C处理的B细胞作为抗原呈递细胞（APCs）。将CD+4T细胞分为4组：A组：正常对照组，即正常小鼠CD+4T细胞；另3组分别为将致敏小鼠CD+4T细胞随机分成的B组：刀豆蛋白A(ConA)刺激组，C组：TP组和D组：DM组。各组加入OVA至终浓度0.2 g/L、ConA至终浓度25 mg/L、1×107个APCs，相应组加入TP至终浓度10-4mol/L，DM至终浓度10-5mol/L。B组取0.5 h、1 h、2 h和4 h时相点，其余组取2 h时相点。GATA3寡核苷酸序列：P1 5′CCT CTA TCT GAT TGT TAG CA，P2 5′ TGC TAA CAA TCA GAT AGA GG，末端标记［γ-32P］ ATP。EMSA反应产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，-70℃放射自显影8 h。相同实验重复3次。（4）凝胶电泳迁移率竞争实验：特异性竞争抑制实验组：加入100倍和200倍未标记GATA3探针；非特异性竞争抑制实验组：加入200倍非特异性的其它未标记探针序列：P1 5′ATA AAA TTT TCC AAT GTA AA，P2 5′TTT ACA TTG GAA AAT TTT AT。
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基质金属蛋白酶2、9及基质金属蛋白酶组织抑制因子1在肺间质纤维化实验中的表达
细胞外基质(ECM)合成和降解失衡是引起ECM积聚导致肺间质纤维化的重要病理生理因素。基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制物（TIMPs）是调节ECM降解的重要体系。我们以博莱霉素诱导的肺间质纤维化大鼠为模型，观察肺间质纤维化发生过程中基质金属蛋白酶2、9（MMP-2、 MMP-9）及基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）基因表达的变化，探讨MMP-2、9和TIMP-1在肺间质纤维化发病中的作用。 材料与方法 (1) 动物模型制备：雌性Wistar大鼠60只(沈阳军区医学专科学校动物实验中心提供)，体重(215±20)g，随机分为：模型组、对照组，每组各30只。模型组吸入乙醚麻醉后，颈前暴露气管，一次性气管内注入0.4%博莱霉素A5(天津华北制药厂)生理盐水注射液（5 mg/kg），制成动物模型。然后分别于第1、3、7、14、28天处死6只大鼠，心脏取血。对照组同样方法注入等量生理盐水，同样天数各处死6只。(2)酶谱分析：根据刘煜等［1］介绍的方法，对标本进行MMPs酶谱分析。(3) Northern Blot：取5 μg大鼠肺组织总RNA，行RT-PCR，引物序列为：MMP-2：5′-AGTGGGACA AGAATCAGATCACAT-3′（上游）， 5′-TCGGTGGTACAGCTGT TGTAAGAG(下游)；MMP-9：5′-AAGCAGACATTGTCAT CCAGTTTG-3（上游），5′-GACAGAAACCCCACTTCTTGTCAG-3′(下游)；TIMP-1：5′-CTCATCGCGGGCCGTTTAAG-3（上游），5′-GAAGGCTTCGGGTCATCGAG-3′(下游)，geneclean纯化回收PCR产物制备探针，随机引物法行α-32P-dCTP标记。20 μg RNA 样品经甲醛变性电泳、转入尼龙膜、65 ℃预杂交1～3 h、65 ℃杂交18 h，常规洗膜及放射自显影。
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心肌细胞再生与心脏修复
长期以来,人们一直认为心肌细胞是终末分化细胞,自身没有再生的能力,心肌细胞生长的惟一形式是肥大.早在20世纪20年代,病理学家在心肌组织切片上未观察到细胞核有丝分裂过程及其他细胞复制的证据,从而认为病理性心脏肥大是心肌细胞的单纯肥大,而不是数量的增加.1965年 Petersen 等对大鼠出生后心脏发育阶段和过度负荷情况下,进行3H标记的胸腺嘧啶掺入观察碱基是否参与心肌细胞核DNA的合成,通过放射自显影的分析中未能检测到DNA的复制.
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分子病理学技术应用原理和适用范围
1 Southern杂交：Southern杂交是1975年由Southem提出，并以其名字命名的一种DNA特定序列定位技术。由于此方法具有特异性强、灵敏度高、应用广泛等优点，已成为DNA分析特别是基因组DNA分析中的常用手段之一[1]。Southern杂交的基本方法是，从组织或培养细胞中获得全部的基因组DNA。以一种或多种限制性核酸内切酶进行消化，通过琼脂糖凝胶电泳按分子量大小分离酶切所得到的片段，然后使这些DNA片段在原位发生变性，并以凝胶转移到另一种固相支持物如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，同时保持各个DNA片段的相对位置不变。再用已标记的(通常为放射性同位素标记，也可用非放射性标记)DNA或RNA探针与固着于固相支持物上的DNA杂交。经放射自显影或化学显色的方法确定与探针互补的电泳条带的位置，从而达到检测和分析的目的。
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HSP70生物学特性及在原发性肝癌中的表达意义
1962年Ritossa在制备果蝇唾液腺细胞染色体的过程中,因疏忽而调高孵箱温度,结果从25℃至30℃的环境变化中观察到特异的染色体松解现象,提示某些位点转录活性增加,称之为热休克反应(heat shock response).1974年Tissieres用放射自显影证实热休克反应中转录合成一组特殊蛋白质,命名为热休克蛋白(hot shock proteins, HSPs).1993年Udono等研究发现肿瘤组织来源的HSP70具有抗肿瘤特异性免疫机能后,其生物学功能和免疫治疗前景得到更为广泛的关注,并取得了重要研究进展[1,2].HSP70在原发性肝癌中表达及作用的研究亦方兴未艾,现就此综述如下.
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
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131I在细胞水平分布的实验研究
目的 用131I放射自显影技术观察其在细胞水平的分布,探讨放射性药物效果预测及评价.方法 采用放射自显影和冷冻切片技术,建立银颗粒密度与放射性药物强度的刻度曲线,确定放射性药物131Ⅰ的微观分布,基于核素的微观分布数据,建立微剂量的剂量估算模式.结果 银颗粒密度与施入放射性药物比活度的相关系数为0.9963,刻度系数为1.59×10-4Bq.结论 131I在细胞水平的分布是不均匀的,银颗粒多数是分布在细胞浆中.因此在计算细胞水平的剂量时应考虑到其分布的不均匀性.
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99mTc-DTPA细胞水平分布的实验研究
目的核医学中传统的MIRD剂量估算方法是假设放射性药物在器官内均匀分布,用器官的平均剂量描述每个细胞及细胞核的剂量.基于核素的微观分布数据,建立微剂量的剂量估算模式,从而为核医学中诊疗计划的制定、放射药物效果和危害的预测及评价、分子核医学研究提供基础的微剂量估算及其分布研究的方法和基础数据.方法采用了放射自显影术和冰冻切片技术,建立自显影银颗粒密度与放射性药物强度的刻度曲线,确定放射性药物99mTc-DTPA的微观分布.结果银颗粒密度与施入比活度的相关系数为0.9915,刻度系数为6.48×10-5Bq.细胞浆与细胞核的分布比为1.78.结论放射性药物在细胞水平的分布是不均匀的,因此在计算细胞水平的剂量时应考虑到其分布的不均匀性.
关键词： 细胞水平 放射自显影 放射性药物 银颗粒 99mTc-DTPA -
99Tcm-MIBI在小鼠肝脏细胞核内的吸收剂量分布研究
目的尝试建立一种微剂量估算模式,评估靶细胞核对放射性药物的准确吸收剂量率.方法以 99Tcm-甲氧基异丁基异腈(MIBI)为例,运用冰冻切片光镜放射自显影技术,观察小鼠尾静脉注射 99Tcm-MIBI 2 h后,肝脏内放射性药物在亚细胞水平分布情况,探索一种符合实际分布情况的数学模式来估算肝细胞核的微剂量率,并与医学内照射剂量(MIRD)估算方式比较,判断两种剂量率估算方法的准确性.结果 99Tcm-MIBI在肝脏亚细胞水平的分布是不均匀的,实际肝细胞核微剂量率数值与利用MIRD模式估算的结果差异有非常显著性(P＜0.01).结论在 99Tcm标记药物非均匀分布情况下,本文作者所建立的微剂量率估算模型,可替代MIRD模式,较准确地估算微剂量率.
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左旋多巴对帕金森病大鼠纹状体多巴胺转运体的影响
目的 研究左旋多巴(L-dihydroxy-phenylalanine,LD)对帕金森病大鼠纹状体多巴胺转运体的影响.方法 采用脑部偏侧注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备PD模型,并将成功模型随机分为PD模型组、LD治疗组,并以正常大鼠作对照,每组9只.其中LD治疗组大鼠给予腹腔注射左旋多巴/苄丝肼 (50mg/kg左旋多巴和12.5mg/kg苄丝肼即左旋多巴和苄丝肼溶于含0.05%的乙醇和0.1%的抗坏血酸的注射用水中,配成10mg/ml),每日两次;PD模型组及正常对照组给予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗坏血酸的注射用水,每日两次.分别于4、6、8周,每组各取3只大鼠,行脑纹状体内多巴胺转运体125I-β-CIT放射自显影,同时用γ-计数器测定纹状体内多巴胺转运体放射活性,计算每克纹状体含放射性占注射剂量的百分比(%ID/g).结果 损毁侧在不同时间段,与正常对照组比较,PD模型组、LD治疗组DAT数量均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01);LD治疗组随时间的延长,呈现递减趋势,但差异尚无统计学意义(P>0.05).健侧在6周时与正常对照组比较,PD模型组及LD治疗组DAT数量降低,差异有统计学意义(P<0.05);LD治疗组DAT数量有递减趋势,但差异无统计学意义(P>0.05).纹状体自显影结果 与纹状体内标志物放射活度测定结果 基本一致.结论 长期每日应用50mg/kg LD治疗PD模型大鼠可能会使纹状体内多巴胺转运体的数量减少.
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局灶性脑缺血大鼠体内与体外结合[3H]MK-801放射自显影的差别和意义
目的:比较体内与体外两种结合[3H]MK-801的方式放射自显影在反映局灶性脑缺血大鼠脑内N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体状态上的差别和意义.方法:线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉,制成局灶性脑缺血模型.以[3H]MK-801为配基,分别进行体内与体外受体结合实验,然后做放射自显影.结果:体内结合实验中,缺血1 h、2 h、4 h组缺血侧损伤区纹状体、皮层[3H]MK-801结合位点密度显著高于非缺血侧(P＜0.05).体外结合实验中,缺血侧半脑[3H]MK-801结合位点分布与非缺血侧无显著性差别(P＞0.05).结论:体内受体结合实验可反映局灶性脑缺血大鼠脑内NMDA受体活性的变化,体外受体结合实验仅反映脑内存在的受体的总数量.
关键词： 放射自显影 局灶性脑缺血 NMDA受体 [3H]MK-801
