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正常与硬化肝组织基因表达差异的初步分析
目的:了解肝硬化的基因表达概况,寻找在肝硬化及正常肝组织中差异表达基因.方法:以各24例肝硬化及正常肝组织的总RNA混合定量后反转录合成含有α-32P dATP的cDNA为探针,与Atlas微阵列表达分析膜杂交.结果:放射自显影结果经AtlasImageTM软件分析显示:在所分析的588种已知基因中,Integrin beta 7、collagen type XVⅢ等17个基因在肝硬化组织中表达上调,TFDP2、BAK、ABL等98个表达下调,参与细胞增生、凋亡、分化、细胞间相互作用、与细胞侵袭相关的基因表达水平发生了明显改变.结论:通过Atlas微阵列系统分析发现的这些基因的表达改变组成了一个肝硬化特异的基因表达谱.系统地研究肝硬化的基因表达改变,与肝硬化发生相关基因的差异变化可为肝硬化诊断和治疗提供线索.
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TRAP银染显色法检测常见肿瘤组织端粒酶活性
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构,人体端粒DNA是六个核苷酸序列(TTAGGG)n组成[1].端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白酶,它能以端粒的3'端为引物,以其RNA组份为模板,蛋白质组份具催化活性,反转录合成延伸端粒重复序列[2,3].为探讨端粒酶在临床常见肿瘤中的作用,我们应用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测端粒酶活性,现将结果报告如下.
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血型糖蛋白AcDNA的克隆及其酵母双杂交系统BD端pGBkT1-GPA质粒的构建
目的:检测红细胞膜跨膜蛋白质--血型糖蛋白A(GPA)对酵母细胞是否有毒性及其能否激活检测基因,以进一步揭示GPA与带Ⅲ蛋白的相互关系.材料与方法:培养红白血病细胞(K562)直到细胞总数达到109以上,收获细胞,用于粗提核内容物的制备.收集增殖状态K562细胞10 mL,提取总RNA以oligo(dT)为引物反转录合成cDNA.参照GPA GENBANK数据库中检索到的序列设计引物,PCR扩增GPA cDNA.PCR产物纯化后,进行补平,平端连接于PUC19质粒上.将经过阳性选择的重组质粒纯化、测序.双酶切PUC19-GPA,产物电泳纯化后加入经相同过程双酶切的PGBKT7,连接产物转化E.coli DH5α.在含卡那霉素平板上筛选阳性重组子,小量提纯质粒,酶切,PCR鉴定.用醋酸锂法将PGBKT7-GPA转染酵母菌,进行细胞计数,计算转染效率,以观察GPA对酵母细胞蛋白表达的影响.结果与讨论:血型糖蛋白A对维持红细胞膜表面负电荷恒定、防止红细胞凝集有重要作用.近年研究表明GPA和红细胞膜上另一种跨膜蛋白--带Ⅲ蛋白在结构与功能上有相关性.酵母双杂交系统是近年发展起来的一种研究蛋白质之间相互作用的体系.该系统不仅可以研究两个已知蛋白的相互作用,而且可以通过构建诱饵蛋白基因从基因文库中筛选出未知基因.本研究采用RT-PCR方法从K562细胞中克隆出GPA的cDNA,重组酵母双杂交系统靶基因载体,构建成pGBKT7-GPA,并转染酵母菌AH109,经检测其对酵母细胞无毒性且不能激活检测基因.因此,pGBKT7-GPA可以作为酵母双杂交系统靶基因.选用RT-PCR技术,从K562细胞中克隆到GPA基因,为国内首次报道.我们曾在国内外首次报道一种新活性的蛋白酶.该酶的活性与带Ⅲ蛋白及GPA-C结构域有关.上述研究结果为进一步研究GPA与带Ⅲ蛋白相互关系打下良好基础.
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端粒酶在肿瘤分子靶向治疗中的研究进展
端粒酶(Telomerase)瞄是一种能延长端粒末端的特异性逆转录酶,以自身RNA为模板,反转录合成端粒DNA重复序列,对细胞增殖、衰老、永生化和癌变起重要作用[1].端粒酶在各类原发肿瘤中的特异性高表达,针对端粒酶的治疗比单纯针对某个癌基因或抑癌基因的治疗具有更为广阔的应用前景,为肿瘤治疗提供了新的思维[2].
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抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库
目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100~600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.
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人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的 环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之 一. 本研究旨在获得hCOX-2 编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌 细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制. 方法 按文献报道的hCOX-2 核苷酸序列设计合成PCR引物,利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SGC 7901中提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序 列测定证实后,利用引物5端引入的EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点,通过粘端连接,将 所获目的 基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中. 对两种重组质粒分别进 行相应的酶切鉴定. 采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞,经G418筛 选 后,随机挑选细胞克隆. 通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩 增获得大小约1.9 kb的特异性片段. 经DNA序列分析,证实与文献报道的hCOX-2编码区序列 一致. 重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ,XbaⅠ双酶切后,产生大 小约5.4 kb,1.9 kb的片段;重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过PstⅠ酶切, 产 生大小约4.5 kb, 1.5 kb与1.3 kb的片段,与预期结果相符. 转染细胞经筛选后,随机挑选 、扩增了3个细 胞克隆,其中1个细胞克隆稳定表达COX-2反义核酸,RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著 下 降. 结论 成功克降了hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表 达载体. 反转录PC R是克隆基因的简便、有效方法. 为扩增高GC含量的cDNA模板,可在PCR引物中加入限制性内 切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆. COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到 稳定转染,转染细胞COX-2 mRNA表达显著受抑制.