反义核酸(antisense nucleic acid)

端粒酶反义核酸对乳腺癌细胞生长的抑制作用

为了探讨针对人类端粒酶RNA(hTR)基因的反义寡核苷酸(AS-ODN)对乳腺癌细胞系MCF-7的影响,将AS-ODN作用于细胞.进行细胞计数,MTT比色法测细胞生长抑制率,PCR-ELISA法测端粒酶活性,流式细胞仪测细胞周期与凋亡.结果表明该AS-ODN能抑制MCF-7细胞生长,降低端粒酶活性并诱导细胞凋亡.针对hTR的AS-ODN对治疗恶性肿瘤有潜在意义.

VEGF反义核酸增强HL60和K562细胞对柔红霉素敏感性

研究发现恶性血液病细胞高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并不同程度表达VEGF受体[1～2],VEGF在白血病中的作用不够明确,可能是通过自分泌作用机制,促进白血病细胞存活和生长、降低白血病细胞对化疗药物的敏感性等.

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用

为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性.结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5 μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P＜0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P＞0.05).结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用.

PIP反义核酸对乙肝病毒PRE转录后调节的影响

目的研究乙肝病毒转录后调节元件(PRE)结合蛋白PIP在PRE转录后调节机制中的作用. 方法用质粒pcDNA3.1(-)构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP;用pAS-PIP转染HepG2细胞,再将依赖于PRE转录后调节的CAT报告质粒转染上述细胞,通过ELISA方法检测CAT的表达水平. 结果成功构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP;基因转染结果显示,与转染空载体组相比,转染pAS-PIP反义核酸组CAT水平下降21.97%. 结论 PIP反义核酸可有效地降低依赖于PRE的CAT的表达,PIP在PRE转录后调节中起着重要的作用.

腺病毒介导反义CⅡTA基因对实验性自身免疫性心肌炎的治疗

目的研究反义CⅡTA基因对心肌肌凝蛋白诱导的实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)的治疗作用. 方法以携带反义CⅡTA基因的腺病毒载体对肌凝蛋白免疫后的小鼠进行静脉注射,同时设立空载病毒组与单纯免疫组作为对照,以多种手段观察反义CⅡTA基因对EAM的治疗效果. 结果治疗组与两对照组相比,心肌病理损伤程度减轻;血浆抗心肌肌凝蛋白抗体滴度及cTnⅠ浓度明显下降(P<0.05),流式细胞术检测外周血与脾脏T细胞I-Ad表达量明显下降(P<0.05). 结论反义C Ⅱ TA基因对心肌肌凝蛋白诱导的EAM具有较好的治疗作用.

端粒酶反义技术治疗恶性肿瘤的研究动态

反义核酸技术根据碱基互补原理,用人工合成或生物体合成的特定的反义核酸来抑制或封闭基因表达,是基因治疗中较具吸引力的手段之一.端粒酶已成为新的肿瘤标志物及肿瘤治疗的新靶点,抑制肿瘤细胞端粒酶活性可望达到抑制肿瘤生长的目的 .本文着重介绍了端粒酶反义技术用于治疗多种恶性肿瘤的研究进展.

VEGF反义核酸调控兔VX2肿瘤早期血管生成的DCE-MRI研究

目的利用DCE-MRI监测血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸调控兔后腿VX2肿瘤早期血管生成的效果,评价反义基因抗血管生成治疗价值以及无创性影像监测方法.方法利用分子生物学方法构建兔VEGF反义基因真核表达载体.将30只新西兰大白兔,平均分5组(A、B、C组为治疗组,D、E组为对照组),建立后腿接种VX2肿瘤模型.采用两种反义基因导入方法,于后一次反义基因导入后0、3、7天分别对各组动物行DCE-MRI检查,计算第一分钟大强化斜率.采用Western Blot和免疫组织化学染色法分析肿瘤组织VEGF表达.结果与对照组比较,A组(治疗后0、3、7天)、B、C组(治疗后7天)肿瘤体积减小(P＜0.05);A组(治疗后0天)、B、C组(治疗后3天)第一分钟大强化斜率显著减低(P＜0.01);A、B、C组VEGF表达明显减低(P＜0.01).结论① VEGF反义核酸可早期有效抑制兔VX2 肿瘤VEGF表达,减少肿瘤血管形成,对肿瘤的生长具有抑制作用.② DCE-MRI可用于监测抗血管治疗早期血管通透性变化.

反义核酸封闭H-2Kd基因对鼠淋巴因子激活杀伤细胞活性的影响

目的观察反义寡核苷酸封闭鼠淋巴细胞H-2Kd基因后,对其表达的影响及淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性改变,探讨淋巴细胞Ⅰ类主要组织相容性抗原(MHC-Ⅰ)在肿瘤免疫中的作用.方法将人工合成的H-2Kd起始区反义寡核苷酸作用于小鼠脾LAK,流式细胞仪检测作用前后H-2Kd的表达率.噻唑蓝法检测H-2Kd表达降低的LAK对肿瘤杀伤活性.结果反义寡核苷酸(15μmol/l)组H-2Kd蛋白的表达率由90.1%±4.4%下降至79.8%±2.5%(P＜0.01),H-2Kd降低的LAK杀伤活性明显降低,对K562的杀伤活性由82.3%±3.1%降到60.2%±6.7%(P＜0.01),对H22细胞株的杀伤活性由67.4%±2.8%降到53.2%±8.1%(P＜0.01).结论反义寡核苷酸能够抑制小鼠LAK表面H-2Kd的表达,但不影响LAK增殖活性,因而可导致鼠LAK对同种及异种肿瘤细胞的杀伤活性降低.

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位反义核酸逆转胃癌细胞多药耐药

目的:对Ro 60反义核酸在逆转胃癌细胞多药耐药中作用进行研究.方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的反义真核表达载体,将其转导入SGC7901细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素.结果:成功构建了Ro 60反义真核表达载体,应用脂质体介导法将其转导入SGC7901-VCR,Ro 60反义真核表达载体转染SGC7901-VCR细胞后,Ro 60的表达量明显下降,体外药物敏感性实验提示其对长春新碱、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性增加,转染反义表达载体的SGC7901-VCR细胞与未转染和转染空载体的细胞相比,IC50值(mg/L)有显著的下降(7.66±0.45 vs 19.56±0.38,17.48±0.85;0.84±0.03 vs 1.62±0.06,1.80±0.03;0.51±0.03 vs 0.87±0.03,0.88±0.03;0.22±0.01 vs 0.52±0.02,0.43±0.03,均P＜0.01),细胞内阿霉素蓄积有显著的增加(51.94±1.26 mg/L vs 36.27±0.98,37.01±0.91 mg/L,P＜0.01).结论:Ro 60反义真核表达载体转染SGC7901后能够抑制胃癌细胞的多药耐药表型.

环氧合酶-2反义核酸对人胆管癌细胞增生的影响

目的:用反义环氧合酶-2(COX-2)重组载体转染COX-2高表达人胆管癌细胞QBC939,观察其对QBC939细胞的生长抑制作用,并探讨其作用机制.方法:通过脂质体介导将COX-2反义核酸质粒转入QBC939细胞,经G418筛选获得稳定表达COX-2反义核酸的胆管癌转染细胞模型.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测转染前后QBC939细胞COX-2 mRNA表达的变化,应用免疫细胞化学链霉亲合素-生物素复合物(SABC)技术检测转染前后QBC939细胞COX-2蛋白表达水平的变化,应用四唑氮蓝(MTT)比色法检测COX-2反义核酸对QBC939细胞增生的影响,应用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡.结果:反义COX-2基因转染后胆管癌细胞中COX-2 mRNA表达水平明显下调,COX-2蛋白表达减弱.转染反义COX-2重组载体的QBC939细胞生长速率明显下降(P＜0.01),细胞周期分析转染后细胞比转染前细胞增生指数显著下降(P＜0.01),S期细胞比例为9.27±1.91%,比转染前(16.35±2.87%)明显降低(P＜0.05),G0/G1期细胞比例为75.16±4.13%,比转染前(57.31±10.16%)明显上升(P＜0.05),细胞被抑制在G0/G1期;COX-2反义核酸转染对QBC939细胞凋亡率无明显影响(P＞0.05).结论:COX-2反义核酸导入可抑制QBC939细胞增生.

hFXYD6反义核酸对胆管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响

目的:研究hFXYD6基因反义核酸对人胆管癌QBC939细胞体外增殖和侵袭能力的影响.方法:构建hFXYD6基因反义核酸真核表达栽体pcDNA3.1(-)/hFXYD6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞,同时设pcDNA3.1(-)空载体对照组和空白对照组.SYBR Green I荧光定量RT-PCR和免疫组化分别检测hFXYD6 mRNA及蛋白表达;MTT、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞hFXYD6 mRNA及蛋白表达量降低;细胞群体倍增时间增加(46.8 h vs 34.5 h,35.3 h),细胞克隆形成率降低(24.3%±5.3% vs 61.0%±8.5%,58.0%±5.6%,P＜0.001);细胞周期中G1期细胞比例明显升高(66.4%±2.9% vs 33.5%±2.3%,39.4%±3.7%,P＜0.001),S期比例明显减少(18.6%±1.6% vs 36.2%±2.1%,34.1%±1.6%,P＜0.001);Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数无显著改变.空白组和空载组细胞间均无明显差异.结论:hFXYD6反义核酸抑制人胆管癌QBC939细胞体外增殖能力,但对其侵袭能力无明显作用.

IRES特异性IRNA在丙型肝炎抗病毒治疗中作用

丙型肝炎基因治疗是目前研究的热点,HCVIRES是丙肝病毒核酸复制和蛋白翻译的关键结构.目前针对IRES结构的治疗策略主要包括反义核酸、核酶、抑制性RNA等.现就抑制性RNA在HCV感染基因治疗中作用研究进展作简要综述.

血管内皮生长因子反义核酸治疗裸鼠皮下种植胰腺癌

目的:探讨抗血管生成基因转染治疗胰腺癌的可行性.方法:构建反向插入VEGF165cDNA的复制缺陷型腺病毒载体,体外转染SW1990细胞,MTT法检测重组腺病毒转染对细胞生长的影响.Northern blot和ELISA检测转染前后SW1990细胞VEGF的mRNA水平和蛋白表达.裸鼠皮下种植瘤瘤体内注射重组腺病毒,CD31染色观察反义VEGF重组腺病毒转染对裸鼠种植瘤微血管密度和肿瘤生长速度的影响.结果:重组腺病毒体外转染并不影响SW1990细胞的生长速度.Northern blot和ELISA检测在mRNA水平和蛋白水平证实反义VEGF重组腺病毒转染对体外培养的SW1990细胞内源性VEGF表达有明显的下调作用.体内实验表明反义VEGF重组腺病毒转染可减少肿瘤内微血管数量,肿瘤生长受到抑制.结论:反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长,为抗血管生成的基因治疗奠定了基础.

反义内皮素转换酶核酸对尘螨过敏哮喘患者外周血单个核细胞释放白细胞介素5的抑制作用

目的探讨转导反义内皮素转换酶(ECE)核酸的气道上皮细胞对尘螨过敏性患者外周血单个核细胞释放Th1/Th2相关细胞因子的影响. 方法尘螨过敏患者21例,分离其外周血单个核细胞(PBMC),根据实验要求分为:未刺激组(A组)、反义ECE上皮细胞+PBMCs组(A1组)、对照组上皮细胞+PBMCs组(A2组)及螨刺激组(B组)、反义ECE上皮细胞+PBMCs+尘螨提取液组(B1组)、对照组上皮细胞+PBMCs+尘螨提取液组(B2组),共培养72 h,螨刺激组同时加入尘螨提取液20 μg/ml.培养上清用酶联免疫吸附(ELISA)法检测白细胞介素5(IL-5)、γ干扰素(IFN-γ). 结果21例患者中有12例患者经尘螨刺激后IL-5 释放明显增加.将12例患者进行统计学分析发现, 未经尘螨刺激时,A1组IL-5和IFN-γ水平分别为[(6.0±1.3)×10-9g/L] 和 [(63±26)×10-9 g/L], A2组为[(7.5±1.1)×10-9 g/L]、[(70±52)×10-9 g/L],两组比较差异均无显著性 (P＞0.05);尘螨刺激后,B1组的IL-5水平和IFN-γ分别为[(8.2±1.6)×10-9g/L]、[(100±41)×10-9 g/L],B2组分别为[(12.0±1.8)×10-9 g/L]、[(153±71)×10-9 g/L],两组IL-5比较差异有显著性(P=0.047),而IFN-γ水平比较差异无显著性(P＞0.05).21例患者中支气管哮喘或哮喘合并变应性鼻炎患者经尘螨刺激后IL-5释放率为(44±15)%, 与单纯荨麻疹患者[(7±4)%]比较,差异也有显著性(P=0.047).结论表达反义ECE核酸的气道上皮细胞通过抑制活性内皮素的生成,下调了尘螨过敏性哮喘及变应性鼻炎患者淋巴细胞分泌IL-5.提示运用反义ECE核酸转化呼吸道上皮细胞的基因治疗策略可能是过敏性哮喘新的治疗思路.

血管内皮生长因子反义核酸增强急、慢性髓细胞白血病细胞对三氧化二砷敏感性的影响

研究发现,某些恶性血液病细胞亦高表达血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体;到目前为止,VEGF和它的受体在白血病发生、发展中的作用还不明确,它对白血病细胞的生存、增殖、分化、化疗药物敏感性的影响等有待揭示[1] .

bcl-2反义核酸增强柔红霉素诱导原代白血病细胞凋亡的研究

研究表明:bcl-2基因的过度表达可明显降低化疗药物引起的细胞凋亡,针对bcl-2 mRNA翻译起始部位的反义核苷酸可抑制许多肿瘤细胞中bcl-2的表达,促进细胞的凋亡,提高肿瘤细胞对化疗的敏感性[1].我们在前一阶段的研究中[2],已经在bcl-2 mRNA翻译起始区和蛋白编码区发现了2个有效反义作用靶点.本研究进一步观察这两个有效序列的反义寡核苷酸是否会增强柔红霉素(DNR)诱导原代培养的急性白血病(AL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)的细胞凋亡,期望为白血病的治疗开辟一条新的途径.

反义核酸逆转人肝癌细胞株多药耐药性的效应

化疗是原发性肝癌晚期病人和术后肝癌复发的主要治疗手段之一,但是肝癌病人对多数化疗药物易产生多药耐药性(multidrug resistance,MDR),导致化疗失败.本研究利用反义RNA技术采用重组腺病毒AdEasy系统,构建了携带反义多药耐药基因片段的重组腺病毒,观察反义核酸对MDR的逆转效应,报告如下.

125I偶联反义核酸对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用

目的观察125I偶联Ki67基因反义核酸(ASODNs)对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用.方法合成ki67基因ASODNs,氯胺-T法125I偶联ASODNs(125I-ASODNs).BALB/c种系裸鼠接种人肾癌786-0细胞.125I-ASODNs治疗组12只瘤体注射125I-ASODNs 0.1 ml(7.4 MBq/L、10 nmol),ASODNs治疗组12只瘤体注射ASODNs 0.1 ml(10 nmol),连续4 d.治疗后第3、6、12 d每组分别处死小鼠4只,取瘤组织检测肿瘤体积,免疫组化、Western blot技术检测Ki67表达,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡率.结果125I-ASODNs组治疗后3、6、12 d小鼠肿瘤体积分别为(51.8±13.7)、(76.1±22.9)、(636.9±73.8)mm3,与ASODNs处理组(70.3±18.9)、(185.7±37.7)、(868.9±128.2)mm3比较,差异有统计学意义(P<0.01);Ki67抗原表达率分别为(16.5±2.1)、(20.8±1.0)、(28.6±2.4)%,ASODNs组为(26.8±2.3)、(29.2±1)、(33.6±2.6)%,Ki67蛋白量比分别为(54.8±2.6)、(58.6±2.9)、(63.9±3.5)%,与ASODNs组(72.6±5.1)、(79.7±3.4)、(85.7±4.4)%比较差异有统计学意义(P<0.01);肿瘤细胞凋亡率分别为(22.6±2.0)、(24.9±2.0)、(27.7±2.2)%,与ASODNs组(15.1±1.6)、(17.8±1.9)、(18.3±2.3)%比较差异有统计学意义(P<0.01).结论125I-ASODNs比ASODNs具有更强的抑制裸鼠肾癌移植瘤生长及促进凋亡作用.

反义寡聚脱氧核苷酸对黑素细胞TYR基因和黑素产量的调控作用

目的设计并合成针对人酪氨酸酶的反义寡核苷酸,从基因表达水平调控细胞黑素的合成,为色素沉着性疾病的治疗寻找新途径.方法将培养的黑素细胞分为内皮素处理组、紫外线处理组和对照组,并分别加入5′端反义核酸、3′端反义核酸、混合反义核酸或单纯脂质体,分别检测黑色素含量和酪氨酸酶mRNA的表达.结果反义核酸对内皮素及紫外线照射引起的黑素细胞色素含量的增加以及TYR基因表达的增强有明显的抑制作用,其中3′端反义核酸作用强.结论反义寡聚脱氧核苷酸对黑素细胞黑素产量和TYR的基因表达有显著的调控作用,3′端反义核酸的调控作用优于5′端反义核酸.