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抑制移植排斥的新途径--CⅡTA 反义RNA的生物学活性
为了探讨CⅡTA的反义RNA对细胞表面主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC,亦称HLA)Ⅱ类抗原表达的抑制作用,克隆与人类CⅡTA基因第114-523位点之间序列互补的反义RNA(arCⅡTA)cDNA序列,并稳定转染Raji细胞,用流式细胞术检测经典MHCⅡ类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)表达,并应用RT-PCR方法检测CⅡTA、经典MHCⅡ类及恒定链的mRNA水平.研究结果表明:arCⅡTA阳性Raji细胞与正义链组比较,HLA-DR、DP及DQ抗原表达分别降低了65.93%、54.14%、68.32%;同时CⅡTA、经典的MHCⅡ类及恒定链的mRNA含量均明显减少(P＜0.05).结论:CⅡTA反义RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法.
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氟伐他汀抑制内皮细胞MHCⅡ表达的研究
目的研究氟伐他汀抑制干扰素-γ(IFN-γ)诱导的内皮细胞表面主要组织相容性抗原复合物Ⅱ(MHCⅡ)表达的作用,并研究其抑制作用的机理.方法通过流式细胞仪检测分析MHCⅡ在内皮细胞中的表达,通过RT-PCR检测Ⅱ类反式激活因子(CⅡTA)mRNA的生成,通过Western blot分析信号转导和转录激活因子1(STAT1)的总量和磷酸化STAT1(P-STAT1).结果氟伐他汀预处理可以抑制由IFN-γ刺激诱导的内皮细胞表面MHCⅡ表达,RT-PCR分析表明CⅡTA mRNA的诱导生成可以被氟伐他汀阻断.Western blot分析表明氟伐他汀预处理并不影响STAT1的总量和在IFN-γ刺激后STAT1的磷酸化.结论在内皮细胞中,氟伐他汀预处理可以抑制由IFN-γ刺激诱导的CⅡTA mR-NA的表达,并因此抑制了细胞表面MHCⅡ表达,这种抑制作用主要发生在CⅡTA的转录水平,可能与转录因子和CⅡTA启动子的结合有关.
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阳离子高分子脂质体介导的 RNA 干扰技术对大鼠 CⅡTA 和 MHCⅡ基因表达的抑制作用
目的：研究应用阳离子高分子脂质体（ cationic polymeric liposomes ， CPLs ）介导的RNA干扰技术对大鼠CⅡTA（MHC class Ⅱ transactivator， CⅡTA）和MHCⅡ基因表达的抑制作用。方法构建CPLs及针对大鼠CⅡTA基因的shRNA（small hairpin RNA， shRNA）3个质粒，并将二者耦合成pCⅡTA-CPLs载体，分别设置空白对照组、单纯CPLs组、pHK-CPLs阴性对照组和3个pCⅡTA-CPLs干预组，于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞（ dendritic cell ， DC），采用荧光实时定量PCR技术检测转染后DC的CⅡTA和MHCⅡmRNA转录水平，流式细胞学技术检测MHCⅡ蛋白表达水平。结果成功构建载shRNA质粒的CPLs，3个pCⅡTA-CPLs组DC转染后的CⅡTA与MHCⅡ mRNA转录水平及MHCⅡ蛋白表达水平均显著性降低（P＜0．01），其中一组pCⅡTA-CPLs 对CⅡTA与MHCⅡ基因表达的抑制更为明显。结论 CPLs是一种较为理想的基因转运载体，应用针对大鼠CⅡTA基因的载shRNA质粒的CPLs载体在体外能够显著性抑制CⅡTA和MHCⅡ基因表达，本实验成果的取得为下一步体内实验提供了实验资料。
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腺病毒介导反义CⅡTA基因对实验性自身免疫性心肌炎的治疗
目的研究反义CⅡTA基因对心肌肌凝蛋白诱导的实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)的治疗作用. 方法以携带反义CⅡTA基因的腺病毒载体对肌凝蛋白免疫后的小鼠进行静脉注射,同时设立空载病毒组与单纯免疫组作为对照,以多种手段观察反义CⅡTA基因对EAM的治疗效果. 结果治疗组与两对照组相比,心肌病理损伤程度减轻;血浆抗心肌肌凝蛋白抗体滴度及cTnⅠ浓度明显下降(P<0.05),流式细胞术检测外周血与脾脏T细胞I-Ad表达量明显下降(P<0.05). 结论反义C Ⅱ TA基因对心肌肌凝蛋白诱导的EAM具有较好的治疗作用.
关键词： CⅡTA 反义核酸 腺病毒 基因治疗 实验性自身免疫性心肌炎 -
CⅡTA与自身免疫性甲状腺疾病
主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子反式激活因子(CⅡTA)是近年来发现的反式转录激活因子,对MHCⅡ类分子的表达起着严格且专一的调控作用,CⅡTA通过作用于多种MHCⅡ类转录激活因子、基础转录复合物及其他转录共激活因子,形成一个更加复杂的复合体来调控MHCⅡ类基因的表达.甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)密切相关.CⅡIA可诱导甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达.对CⅡTA基因结构和功能的研究将促进对MHCⅡ类分子表达调控机制及AITD发病机理的认识.
关键词： CⅡTA MHCⅡ类分子 自身免疫性甲状腺疾病 -
强的松对CⅡTA调节HLA作用的影响
目的:研究强的松对人PBMC CⅡTA转录的调节,从基因水平探讨糖皮质激素对HLA的调控作用及其调控机制.方法:用强的松干预经IFN-γ联合PHA 刺激诱导活化的正常人PBMC,采用RT-PCR方法扩增其CⅡTA mRNA,并对处理后PBMC CⅡTA转录水平与未诱导的组成性及活化后的诱导性CⅡTA转录水平进行分析比较.结果:体外培养的正常人PBMC组成性表达CⅡTA,经IFN-γ联合PHA活化后表达增加,强的松干预后,表达量明显减少.结论:强的松对IFN-γ诱导活化的PBMC CⅡTA转录有抑制作用,对HLA表达的抑制作用可能与下调CⅡTA转录有关.
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两种抑制MHCⅡ类分子表达方法的比较
目的:评价CⅡTA(MHC class Ⅱ transactivator, CⅡTA)基因突变体和反义RNA对MHCⅡ类分子的抑制效率和胞内稳定性,为改造MHC分子奠定基础.方法:用PCR、酶切及连接技术,构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2,含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3突变体及CⅡTA基因的反义RNA-pcDNA3/CⅡTA反.用脂质体转染法,将突变体、反义RNA及空载体pcDNA3转入PIEC细胞和L23细胞中.持续四个月,流式细胞术观察它们对PIEC/L23细胞株MHCⅡ类(SLA-DR)分子的诱导性和组成性表达的影响.结果:转染pcDNA3、pcDNA3mCⅡTA2后,PIEC/L23细胞SLA-DR的表达没有受到抑制,转染pcDNA3mCⅡTA3后,9/20(45.0%)的PIEC细胞、10/20(50.0%)的L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制,抑制率高达90%以上;转染pcDNA3mCⅡTA反后,7/15(46.7%)PIEC细胞、5/15(33.3%)L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制,抑制率高达85%以上.持续检测4个月,转染pcDNA3mCⅡTA3的PIEC/L23细胞SLA-DR的表达受抑率均在90%以上.转染反义RNA的PIEC/L23细胞在第65/45天,SLA-DR表达抑制率降至10%以下.结论:构建成功的CⅡTA突变体和反义RNA均能有效抑制SLA-DR表达,但CⅡTA突变体稳定存在于胞内的时间长,构建突变体是利用CⅡTA抑制MHCⅡ类分子的好方法.
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雷公藤内酯通过下调CⅡTA抑制BV-2小胶质细胞MHCⅡ表达
目的 观察雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2小胶质细胞MHCⅡ分子表达的影响,并探讨其相关的分子机制.方法 将BV-2细胞随机分为对照组、海人酸组、雷公藤内酯组,免疫组化方法检测雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2细胞MHCⅡ和CⅡTA蛋白的影响.结果 对照组MHCⅡ阳性BV-2细胞为(0.059±0.005),海人酸组MHCⅡ阳性BV-2细胞为(0.893±0.038),经统计学处理二者存在显著性差异(P＜0.05).雷公藤内酯组MHCⅡ阳性BV-2细胞率(0.089±0.013),与海人酸组比较二者存在显著性差异(P＜0.05);对照组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.043±0.003),海人酸组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.692±0.015),经统计学处理二者存在显著性差异(P＜0.05).雷公藤内酯组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.057±0.009),与海人酸组比较存在显著性差异(P＜0.05).结论 雷公藤内酯可以抑制海人酸活化的BV-2细胞MHCⅡ表达,其机制可能与下调BV-2细胞CⅡTA表达有关.
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068 CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活作用
CⅡTA(MHC classⅡtransactivator)指MHCⅡ类分子反式激活因子,与MHC Ⅰ/Ⅱ类基因及各种抗原递呈相关基因的表达密切相关,涉及的机理较为复杂.本文拟就CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活机理作一综述.
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012 CⅡTA研究进展
CⅡTA(MHC classⅡtransactivator)是近年新发现的转录活化因子,对MHCⅡ类分子的表达起严格且专一的调控作用.CⅡTA通过其细胞和组织专一性的启动子表达不同的转录本,并以此调节MHCⅡ类分子在不同组织及时段的特异性表达.CⅡTA蛋白与基础转录复合物及多种MHCⅡ类基因转录因子之间存在相互作用,并与之形成复合物以实现转录活化功能.对CⅡTA基因结构和功能的研究将极大地促进其在免疫调节和疾病治疗研究中的应用.
关键词： 主要组织相容性复合体 CⅡTA 基因调节 -
CIITA反义RNA抑制MHC Ⅱ类分子表达
为探索利用CIITA(MHC classⅡtransactivator)基因反义RNA抑制MHC Ⅱ类分子表达的可能性,为CIITA的应用研究奠定基础.利用RT-PCR扩增能与CIITA cDNA第95至500 bp互补的片段,并构建成pcDNA3/CIITAa重组质粒,脂质体转染法将其转入人HeLa/Raji细胞和猪PIEC/L23细胞,流式细胞术动态检测反义RNA对人/猪MHCII类分子的抑制率和抑制程度.结果显示HeLa、Raji、PIEC和L23四种细胞MHCⅡ类分子受抑制率分别为46.7%(7/15),40%(6/15),46.7%(7/15)和33.3%(5/15).典型受抑克隆细胞MHCⅡ类分子受抑程度高达85%,反义RNA对MHC Ⅱ类分子的抑制时间持续35～50 d.CIITA反义RNA能有效抑制人/猪MHC Ⅱ类分子的表达,它在自身免疫和移植免疫中有一定的应用前景.
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CⅡTA与疾病的关系及潜在应用前景
近年来发现的MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC classⅡtransactivator,CⅡTA)是对MHCⅡ类分子起严格且专一调控作用的转录激活因子.CⅡTA的表达对维持机体免疫功能的稳定与平衡至关重要,其异常表达与多种感染性疾病及自身免疫病的发生发展密切相关.CⅡTA及其人工修饰构建的突变体在这些疾病的预防和治疗中有着广泛的应用前景.
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HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响
目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.
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主要组织相容性复合体Ⅱ类分子反式激活因子的研究进展
主要组织相容性复合体Ⅱ类分子反式激活因子(MHC classⅡtransactivator,CⅡTA)是1993年发现的反式转录激活因子,被认为是MHCⅡ类分子表达的主要调控因子.本文就CⅡTA的结构、功能以及对MHC基因调节及其应用前景作一综述.
关键词： CⅡTA 主要组织相容性复合体 移植排斥 -
CⅡTA基因修饰树突状细胞增强荷肝癌小鼠抗瘤效应
目的: 探讨MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱtransactivator)CⅡTA基因对树突状细胞(Dendritic cell,DC)表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的上调作用,为肝癌生物治疗提供新的思路.方法: 从小鼠骨髓中大量扩增DC,并用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及CD80、 CD86的表达.建立小鼠肝癌模型,将荷肝癌小鼠分为4组,第1组:分别于肝癌组织块周围注入PBS; 第2组: 未转入mCⅡTA基因的DC; 第3组: 转入mCⅡTA基因的DC; 第4组:转入mCⅡTA基因并经H22肿瘤抗原刺激的DC.每周1次,连续接种3 wk,连续7 wk动态测量肝癌的大小,观察转染mCⅡTA基因对荷肝癌小鼠抗瘤效应的影响.结果:转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05).免疫接种后,第4组荷肝癌小鼠肝癌组织块的平均面积明显小于第1、 2、 3组(在第3、 4、 5、 6、 7周时,与第1、 2组相比较,P<0.05;在第5、 6、 7周时与第3组相比较,P＜0.05). 结论: 转入mCⅡTA后,DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调,DC的抗瘤效应增强.本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗提供了新的途径.
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CⅡTA-pI在树突状细胞中特异启动活性的研究
目的:检测MHCⅡ类分子反式激活因子Ⅰ型启动子(CIITA-pI)是否具有启动活性及其在树突状细胞(dendritic cell, DC)中的特异启动活性.方法:利用荧光素酶报告系统, 检测仅112 bp的Ⅰ型CIITA-pI在DC中的特异启动活性及报告基因在DC不同成熟程度下的表达.结果:该启动子在DC中能够特异启动报告基因的表达, 而在非DC细胞中几乎无启动活性; 其启动活性随DC的成熟程度而上升.结论:为进一步应用CIITA-pI作为DC特异性启动子进行靶向基因治疗奠定了基础.
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构建可抑制HLA-DR/DQ表达的MHC-Ⅱ类分子反式激活因子基因的突变体及其机制
目的:构建能抑制MHC-Ⅱ类分子表达的MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator, CⅡTA)基因的突变体, 并探讨其抑制MHC-Ⅱ类分子表达的机制.方法: 用PCR、酶切及连接技术, 构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2, 含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3以及含起始密码子及NLS(nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体.用脂质体转染法, 将上述3种突变体及空载体pcDNA3转入Hela细胞和Raji细胞中.用流式细胞术和RT-PCR法, 观察他们对Hela/Raji细胞HLA-DR/DQ分子的诱导性和组成性表达的影响.将mCⅡTA4转移到对四环素浓度依赖的质粒pUHD10-3上, 通过改变培养环境中四环素的浓度, 调节外源CⅡ TA突变体的表达量, 观察突变体的表达量与MHC-Ⅱ类分子受抑率的关系.结果: 细胞和基因水平证实, pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对Hela/Raji细胞HLA-DR/DQ的表达均有明显的抑制作用; 而pcDNA3mCⅡTA2和空载体pcDNA3无此作用.MHC-Ⅱ类分子被抑制的程度与外源转入CⅡTA突变体(pUHD10-3mCⅡTA4)的量明显相关.结论: 成功地构建pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4, 并能抑制HLA-Ⅱ类分子的表达.初步证实CⅡTA突变体是通过与胞内的野生型CⅡTA竞争性结合反式激活蛋白, 来抑制MHC-Ⅱ类分子的转录和表达.
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反义CⅡTA基因对鼠异位气管移植慢性免疫排斥反应的抑制作用
目的:构建携带鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ molecule transactivator,CⅡTA)反义RNA的腺病毒载体,观察腺病毒介导该基因对小鼠异位气管移植慢件免疫排斥反应的抑制作用.方法:设计鼠CⅡTA mRNA为模板的反义片段,构建可表达反义片段的腺病毒载体(AdEasy-1系统),经HEK293细胞包装产生含反义片段重组腺病毒Ad-asCⅡTA,扩增、纯化.建立小鼠异位气管移植模型,用包装后的腺病毒注射并感染移植体周围,观察其对免疫排斥反应的抑制作用.结果:成功包装出含CⅡTA反义基因的重组腺病毒;重组腺病毒可感染气管移植体,Ad-asCⅡTA感染组移植气管组织炎症反应和纤毛上皮变性坏死等较对照组明显减轻.结论:重组腺病毒表达的小鼠反义CⅡTA基因能通过对MHCⅡ类分子的抑制而抑制异位气管移植的慢性免疫排斥反应.这为气管移植治疗气管肿瘤和气管狭窄等疾病奠定了一定的实验基础.
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乙型肝炎慢性化与CⅡTA基因启动子区多态性的相关性
目的: 探讨CⅡTA基因启动子区的多态性与乙型肝炎慢性化的相关性. 方法: 用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)及DNA测序方法对102例慢性乙型肝炎患者和80例正常对照者外周血白细胞基因组DNA的CⅡTA基因Ⅰ, Ⅲ及Ⅳ3个启动子的基因多态性进行分析. 结果: 102例患者和80例正常人CⅡTA基因的第Ⅰ, Ⅲ及Ⅳ3个启动子的PCR产物均呈一带型,未发现异常泳动. 结论: PCR-SSCP分析显示CⅡTA基因的第Ⅰ,Ⅲ及Ⅳ3个启动子在所研究的人群中不存在多态性,提示CⅡTA基因启动子区存在保守性.
