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人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的 环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之 一. 本研究旨在获得hCOX-2 编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌 细胞，以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制. 方法 按文献报道的hCOX-2 核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SGC 7901中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序 列测定证实后，利用引物5端引入的EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点，通过粘端连接，将 所获目的 基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中. 对两种重组质粒分别进 行相应的酶切鉴定. 采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞，经G418筛 选 后，随机挑选细胞克隆. 通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩 增获得大小约1.9 kb的特异性片段. 经DNA序列分析，证实与文献报道的hCOX-2编码区序列 一致. 重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ，XbaⅠ双酶切后，产生大 小约5.4 kb，1.9 kb的片段；重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过PstⅠ酶切， 产 生大小约4.5 kb, 1.5 kb与1.3 kb的片段，与预期结果相符. 转染细胞经筛选后，随机挑选 、扩增了3个细 胞克隆，其中1个细胞克隆稳定表达COX-2反义核酸，RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著 下 降. 结论 成功克降了hCOX-2编码基因序列，并构建了其正、反义真核表 达载体. 反转录PC R是克隆基因的简便、有效方法. 为扩增高GC含量的cDNA模板，可在PCR引物中加入限制性内 切酶位点，可以方便地实现基因的定向克隆. COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到 稳定转染，转染细胞COX-2 mRNA表达显著受抑制.
