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应用液氮改良冷冻切片的体会
冷冻切片一般多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等,组织块不经任何包埋剂包埋而直接放置在冷台上冷却后进行切片.然而,富于脂肪组织的新鲜标本或固定后的标本却难以冷冻,或不能切片.
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抗原修复技术研究发展的新起点
7年多前,我们曾经受贵刊编辑部之邀发表过“抗原修复技术研究进展”一文[1]。在那篇文章里,尽管已经有片言只语提到可以应用抗原修复技术原则从石蜡切片中提取蛋白质和核酸。但是,全文的主题与绝大部分内容还是局限在免疫组织化学染色的问题方面。转瞬过去的7年在后基因组时代的舞台上大放异彩,高通量检测数以千计的蛋白质组学分析技术的开发以及各种形形色色的蛋白质质谱分析技术的开发,在探讨人类疾病的多种相关生物标志物及其在诊断治疗上,正在扮演着先锋作用的重要角色[2-4]。图像质谱分析是近开发出来的一门新技术,它是建立在质谱分析法特别是通过基质辅助激光解析( matrix-assisted laser desorption ionization )技术或者次级离子质谱分析法( secondary ion mass spectrometry )能够在一张组织切片上进行蛋白质、脂质等细胞组成成分在组织结构内的质谱分析。1997年,离子质谱分析法( IMS )早由Caprioli的实验室发表。此后不久即开始用于临床研究,如癌组织中HER2表达以及分布等的研究显示出颇具魅力的发展前景。但是,这些新兴的技术从开始起步就面临着和20多年前免疫组织化学在常规甲醛固定石蜡包埋( FFPE )组织切片染色上同样的尴尬局面:必须依赖新鲜组织冷冻切片。随着抗原修复技术在石蜡切片免疫组织化学染色的广泛推广,人们从数以万计的近代有关加热抗原修复技术的文章中,毫不怀疑地认识到,加热抗原修复技术在免疫组织化学染色等方面取得的优异成果,开启了如何把现代分子生物学技术用于FFPE组织科研宝库的途径。继免疫组织化学染色之后,加热抗原修复技术的基本原理已经成功地被用于包埋前、后免疫电镜染色,核酸原位杂交,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记,从石蜡包埋组织中提取蛋白质或核酸等一系列的重要成绩。2008至2011年期间,意大利的Ronci等[5]、澳大利亚的Gustafsson等[6]、美国的Casadonte和Caprioli[7]相继发表了他们经过反复试验、成功地采用加热抗原修复技术方法,使得IMS能够用于常规FFPE组织切片的文章,由于从事IMS技术开发的科学家们逐渐从与日俱增的加热抗原修复在免疫组织化学染色等方面令人瞩目的成绩中,认识到FFPE人体组织是不可取代的极为宝贵的科学研究资源,任何一种现代化的分子生物学技术都不能够仅仅局限于新鲜组织冷冻切片。必须千方百计地寻求一种能够克服FFPE处理给予组织内高分子成分带来的负面影响的有效方法。于是,一切从事与常规FFPE组织标本相关联的科学研究和技术开发都顺理成章地归结到加热抗原修复技术。有力地证明这一极为简单的加热修复方法的确提供了解放石蜡组织中的蛋白质等高分子结构成分的坦途,开启了为病理学家和形态学家步入分子病理学、形态学的大门。
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应用皮肤再生医疗技术成功救治特重度烧伤一例
大面积深度烧伤的治疗一直是烧伤治疗的永久性课题,它的愈合是烧伤治疗水平的体现.传统的治疗方法是削、切痂植皮,采用手术的方法封闭创面.皮肤再生医疗技术则是采用非手术的方法使烧伤坏死组织逐渐脱落,在新鲜组织上培养出上皮细胞,再生后逐渐融合扩大到覆盖创面,后痊愈.
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
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深低温角膜保存的研究进展
深低温冷冻保存法是目前保存供体角膜时间长的保存方法.其保存效果与新鲜组织无异,故越来越受到研究者的关注.本文旨在对该保存法的研究进展作一综述.
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异基因造血干细胞移植治疗难治复发NK/T细胞淋巴瘤一例
患者,女,31岁.于2004年11月开始反复感冒,伴低热、鼻塞,检查发现鼻腔上端息肉,行鼻腔息肉切除术.病理检查结果示新鲜组织被鳞状上皮覆盖,溃疡形成.间质水肿,明显坏死.
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快速冰冻病理切片专用箱在临床送检中的应用
随着医学手术水平的不断提高,手术中要求快速冰冻病理切片进行病理送检诊断日益增多。快速冰冻病理切片是低温条件下将新鲜组织快速冷冻到一定硬度,然后进行切片的一种方法。为保证快速冰冻病理切片的安全和质量,在临床送检过程中使用快速冰冻病理切片专用箱,改变以前使用治疗盘及塑料袋送检的方法,送检安全、临床应用效果好,现报道如下。
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云南白药加食醋治疗带状疱疹
1998年1月-2000年10月共收治带状疱疹病人30例,均采用云南白药、食醋(5%醋酸)治疗,疗效显著,现介绍如下.1 治疗方法首先用3%过氧化氢及灭菌生理盐水冲洗带状疱疹区域,再用无菌针头刺破水疱使疱内液体流出,并用棉签将破溃的坏死组织轻轻擦去,直至露出新鲜组织且有少量渗血为止.然后用消毒的压舌板将云南白药与食醋调匀的糊状物涂于创面(1mm厚),每日2次,直到创面愈合.
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巧用厨房用钢丝球清创乙级、丙级愈合切口与各种陈旧感染创面
临床许多乙级愈合切口、丙级愈合切口及陈旧感染创面为促进切口、创面愈合要进行清创,传统清创法用刀片刮或切后冲洗,去除腐肉、脓苔,达到清创目的.但对Ⅲ度压疮清创,刀片清创操作不方便、不彻底,想彻底清创有时需切掉部分新鲜组织,造成很大创伤.
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组织固定的探讨
固定是将新鲜组织浸人某种固定剂内,使细胞内蛋白质凝固,从而防止组织的死后变化,将生活时的结构保存下来,使组织的形态结构与生前相仿.
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缺铁性贫血与脾虚证大鼠小肠微绒毛结构变化的相关性研究
1 材料与方法 Wistar大鼠,体重(200±20)g,雌雄各半,共50只,安徽医科大学动物实验中心提供.将大鼠随机分为3组,正常组、脾虚证组、缺铁性贫血组,每组10只.适应性饲养10天后造模.脾虚证每天每只喂以低蛋白饲料(蛋白含量<7%)3~4g,新鲜青菜4g左右,不定量水,20天后造模成功,大鼠出现体重减轻、毛髭、活动少,稀便.缺铁性贫血组每天每只给以去铁性饲料,不定量水,隔天从尾静脉放血1.5~2ml,20天后查血红蛋白,血红蛋白含量小于8g/dl,缺铁性贫血大鼠模型复制完成.正常组以正常饲料喂养20天后,处死大鼠,取小肠新鲜组织,电镜观察(sirion200场发射扫描电镜,中国科技大学提供)各组小肠绒毛变化.
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新鲜肺癌组织的DNA含量分析
目的:研究新鲜肺癌组织的DNA含量.方法:采用流式细胞术对30例新鲜肺癌组织和5例正常对照组组织制成的单细胞悬液进行了DNA含量分析.结果:肺癌组G0/G 1、S、G2/M各时相比率和细胞增殖指数以及DNA指数与对照组存在显著性差异(P<0.01).结论:肺病变组织细胞DNA 的流式细胞术分析是判定肺部肿瘤恶性化的敏感指标.
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MEBO治疗带状疱疹2例
1 病例介绍例1:患者,女,75岁,因带状疱疹15d不愈,且泛发周身各处,面积很大,于1999-04-10转入我院,该患15d前发病起疹,形成水泡,因用手搔抓止痒,疱皮破溃且糜烂,有脓性分泌物及恶臭味,疼痛加剧,伴发热和全身不适.体温:38.9℃,WBC 3.4×109/L,创面细菌培养为革兰氏阴性菌,在采用支持疗法和静脉滴注广谱抗生素及病毒唑的同时,将糜烂感染的创面用消毒液清洗,并清除坏死组织,将MEBO直接涂在创面上,厚度2mm左右.涂药后10min,病人疼痛明显缓解,并能入睡.始终保持创面湿润,不发生药物堆积,每6~8h更换MEBO一次,每次涂药前清除坏死细胞液化物及陈旧药物,同时隔离病人,防止交叉感染.治疗1周后,创面有新鲜组织生长且创面不发痒,疼痛减轻,涂药改为每日一次,4周后病人痊愈出院,末留瘢痕.
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不同方法制备大鼠脊髓新鲜组织片及免疫组织化学实验的比较
在免疫组织化学的实验中,有一些抗体要求必须在新鲜的组织上进行实验才能有较好的表达.本实验探讨了不同方法制备大鼠脊髓新鲜组织片,并以NMDA-NR2A和NR2B多克隆抗体(一抗)作免疫组织化学实验,对它们的组织形态和表达结果等进行比较,兹介绍如下.
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胃癌细胞内在耐药性与MDR1基因表达产物P-gp相关性研究
本研究旨在探讨胃癌新鲜组织对化疗药物内在耐药性(intrinsic drug resistance,IDR)的产生与MDR1基因产物P-gp表达的相关性,以及探讨P-gp对临床选用化疗药物的参考价值.
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一种改进的非酶处理分离新鲜肾癌组织中浸润淋巴细胞的方法
目的 建立一种快速简便的不经过消化酶处理而直接分离、纯化新鲜肾癌组织浸润淋巴细胞的新方法.方法 手术切除的新鲜肾癌组织经过机械剪碎、温和匀浆处理制备成单细胞悬液,再通过Ficoll密度梯度离心分离肿瘤浸润淋巴细胞,密度梯度分离后经CD3磁珠分选纯化.结果 成功建立了快速从新鲜肾癌组织分离肿瘤浸润淋巴细胞的新方法,成功完成7例组织分离.分析结果显示CD3+T细胞占(24.10±17.60)%,CD4+和CD8+细胞分别占(37.69 ±9.83)%、(37.86±10.47)%;进一步经磁珠纯化后CD3+T细胞纯度达91.6%,适用于后续分析.结论 本法优势在于:①与酶消化法相比,有利于保护细胞膜表面受体,大程度全面反映肿瘤组织中淋巴细胞亚群的浸润情况;②短暂、快速、温和匀浆处理,操作时间短,有利于维持细胞的高活力.
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端粒酶活性检测乳腺癌
国际癌症研究资料表明,I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌的5年生存率分别为80%、52%、42%和14%,这充分说明乳腺癌早期发现、早期诊断、早期治疗直接影响着预后效果。而目前,我国主要以红外线、B超等技术诊断乳腺癌的方法很难做到“早”。山西省肿瘤医院病理科主任王全红等5名研究人员应用端粒酶活性检测技术,对80例乳腺癌新鲜组织(包括30例乳腺癌,30例乳腺正常组织和20例乳腺良性肿瘤)对比分析,发现端粒酶在癌组织周围的正常乳腺组织和良性肿瘤中基本无表现,而在乳腺癌中表达率为90%,在转移的乳腺癌原发癌中表达率为100%,这为诊断乳腺癌提供了分子水平的客观指标,经查新检索,在国内无同类报道。该方法已通过了山西省科委的专家鉴定。
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肺癌石蜡包埋组织及新鲜标本组织芯片制备方法学探讨
目的:探讨和建立石蜡包埋组织和新鲜冷冻标本制备组织芯片的方法,以及在基因表达分析中的应用.方法:选取肺癌石蜡包埋组织90例,新鲜液氮冻存肺癌及癌旁肺组织20例,常规切片HE染色下确定穿刺部位,石蜡包埋组织芯片制作按Kononem等方法(1998),每例穿取0.6 mm组织柱2条,制备180点阵组织芯片;而新鲜组织芯片参考Fejzo 等方法(2001),并略作改良,制备50点阵组织芯片.所有组织芯片模块,经4 μm切片、常规组织学染色和免疫组化染色,以评价其在形态学及基因表达分析中应用的可行性.结果:180点阵石蜡包埋肺癌组织芯片,组织排列整齐,HE染色后组织形态可观察率在98%以上;p53、c-myc、bcl-2、bax和Ki-67等免疫组化染色后,肺癌组织可见不同程度的抗原表达,组织点阵的形态可观测率在89%~95%之间.新鲜组织芯片经HE染色后,形态可观测率和基因表达可分析率在70%左右.结论:手工法组织芯片制备简便易行,使用组织少,不破坏原蜡块;实验均一性、可比性好,且节省试剂.与常规组织切片相比,2点0.6 mm组织可以获得原蜡块95%以上的信息,完全可以用于组织形态学和蛋白水平上的基因表达分析;新鲜组织芯片技术已经初步建立,但尚有待于进一步完善制备技术和mRNA 分析方法.
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不同组织中DNA提取及其影响因素分析
根据医疗科研的需要,我们分别从人全血、新鲜组织及OCT包埋冰冻组织中提取DNA,提取的方法各有不同,特别是我们自己摸索了一套提取OCT包埋冰冻组织DNA的方法.在实验过程中,分别总结了各方法的影响因素,供实验工作者应用时参考.
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肛周脓肿合并急性坏死性筋膜炎1例临床护理
2010年11月,我们收治1例肛周脓肿合并急性坏死性筋膜炎患者,经积极治疗与精心护理,效果满意.现报告如下.1 临床资料患者男,56岁,入院前8 d出现会阴部疼痛,于当地医院就诊,给予输液及口服药物治疗(具体不详)未有明显缓解,3 d前患者行走时发现肛周疼痛不适,不能正常走路及平卧,半天前症状加重,于11月6日来我院急诊科就诊.B超检查:会阴部弱回声占位(脓肿部分液化型),以"肛周脓肿"收入我院中西医结合科治疗.专科情况:肛门位置居中,肛门左侧红肿大小约15 cm×15 cm,皮温高,触痛,有波动感,患者疼痛明显,未行直肠指检.完善术前检查后随即在腰腧穴麻醉下行"肛周脓肿切开引流术",于肛缘截石位1、3、5、6点位分别行放射状切口,引流出脓血性分泌物约400 ml,局部大量筋膜坏死,切除坏死组织至新鲜组织处,3%过氧化氢反复冲洗.术野无活动性出血,艾力克纱条填塞伤口,塔形纱加压包扎.