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致病性猪链球菌主要毒力因子基因多重PCR检测
目的建立多重PCR体系,实现猪链球菌毒力相关因子基因cps、mrp、epf(epf*)和sly的同步检测.方法根据上述毒力因子基因核苷酸序列,设计和合成4对特异性引物,通过体系和条件优化,建立多重PCR检测方法,并对72株种属背景明确的实验菌株(其中猪链球菌48株、阴性对照株24株)及49株猪临床分离的链球菌样本进行检测分析.结果48株猪链球菌中,c加2检出率为33 3%(16/48)、mrp检出率为29.2%(14/48)、epf检出率为25%(12/48)、epf*检出率为6.3%(3/48)、sly检出率为54.2%(26/48),上述检测结果与菌株的毒力因子背景情况完全相符;24株阴性对照和49株猪临床分离样本毒力因子检测结果均为阴性.结论多重PCR可用于猪链球菌毒力相关因子CPS2、MRP、EF、Sly的基因检测,特异性和敏感性好,为该病快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术手段.
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保加利亚乳杆菌胞外多糖对人癌细胞抑制作用的研究
乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的黏液或荚膜多糖.已有的一些报道表明:乳酸菌EPS通过抑制肿瘤、抗溃疡、免疫调节和降低胆固醇活性进而对人体健康产生促进作用.Oda等[1]早在20世纪80年代就确定了由瑞士乳杆菌约古特亚种(Lb.helveticus ssp.jugurti)产生的EPS具有抑制肿瘤活性.
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b型嗜血流行性感冒杆菌在急性下呼吸道感染病原学中的地位
流行性感冒(流感)嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,Hi)是常见的致病菌,仅对人类致病.1931年,Pittman将Hi分为带荚膜菌株及不带荚膜菌株(不定型),荚膜菌株据荚膜多糖的特异性抗原不同分为6个血清型(a～f),其中b型(Hib)毒力大.Hib通过飞沫传播,是引起儿童侵袭性感染的重要致病菌,主要感染5岁以下儿童,是小儿败血症、脑膜炎、肺炎的主要致病菌.1968年,人们即认识到Hib发病率高,致死率高.近年来,人们发现,Hib对氨苄青霉素及其它一些抗生素的耐药率在增高.
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B 群脑膜炎球菌荚膜多糖分子大小分布和结构特性分析
目的：分析B群脑膜炎球菌荚膜多糖的分子大小分布和结构特性，为B群多糖类疫苗的研制提供理论依据。方法 Sepharose CL-4B柱层析分析B群荚膜多糖分子大小分布；基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱（ matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry ，MALDI-TOF-MS）分析B群荚膜多糖重复单位相对分子质量；以C群荚膜多糖及唾液酸为对照，用核磁共振（ Nu-clear magnetic resonance ， NMR）法分析B群荚膜多糖的结构，通过各特征质子的化学位移分析其结构特征。结果15株B群菌株的粗制荚膜多糖分配系数K D值在0．60～0．76之间；重复单位相对分子质量为284，与其理论重复单位相对分子质量284一致。 B群荚膜多糖是由唾液酸为重复单位组成的，为2→8键连接，其中不含O-乙酰基修饰。结论 B群脑膜炎球菌荚膜多糖相对分子质量较小，这可能是引起其弱免疫原性的重要因素。通过NMR法能够实现对B群荚膜多糖结构的快速、准确分析。
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几株b型流感嗜血杆菌多糖结合物的免疫原性检定
目的 从分子水平检定b型流感嗜血杆菌,研究不同菌株荚膜多糖结合物的免疫原性.方法 提取基因组,通过型特异和荚膜型基因特异引物,利用PCR检定b型流感嗜血杆菌；不同纯化多糖分别与破伤风类毒素(TT)进行耦联结合,结合物原液经稀释免疫小鼠,通过两针免疫,采血进行免疫效力测定.结果 5株b型流感嗜血杆菌通过PCR法均能获得预期大小的型特异(482 bp)和荚膜型(343 bp)基因片段,BLAST分析显示,各菌之间型特异和荚膜型序列比对,其同源性均为100％,各菌型特异和荚膜型序列分别与GenBank X78559.1和M19995.1序列比对,同源性分别为99％和100％；ELISA检测显示,4株不同菌株来源的荚膜多糖结合物(PRP-TT)的小鼠免疫效力差异无统计学意义.结论 通过PCR法从分子水平检定b型流感嗜血杆菌,纯化的不同荚膜多糖结合物小鼠免疫原性基本一致.可供不同Hib多糖结合物免疫原性的研究参考数据.
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A、C群脑膜炎奈瑟球菌免疫原性及毒性和传代稳定性研究
目的 为保证疫苗质量的一致性和可控性,对A、C群脑膜炎奈瑟球菌结合疫苗生产用菌株CMCC(B)29201和CMCC(B)29205株进行毒性和抗原传代稳定性研究,并对30代次菌进行脑腔毒性、免疫原性和产糖质量分析.方法 将A、C群脑膜炎奈瑟球菌工作种子批菌种分别连续传代至30代次并收获3、5、10、15、20、25及30代次菌液,小鼠腹腔注射观察各代次毒性,试管凝集试验和间接ELISA测定各代次抗原性.其中30代次菌液进行小鼠脑腔攻击观察是否引起脑组织病理改变,小鼠皮下免疫观察免疫原性,同时进行发酵培养提取荚膜多糖的质量分析.结果CMCC(B)29201株和CMCC(B)29205株工作种子批菌种的半数致死量(LD50)均≥109个/ml,30代次内的LD50也均≥109个/ml,30代次菌液脑腔毒性测定显示均无病理改变;抗原性试管凝集效价均达1∶320,30代次内的试管凝集效价均达1∶320,ELISA几何平均滴度(GMT)分别为1∶4835和1∶3915,且30代次内的ELISA效价分别为1∶4315和1∶3752以上;30代次菌液的血清杀菌抗体均≥1∶32,用第30代次工作种子批菌种生产的A群和C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖各项检定指标均达到国家标准.结论 A、C群脑膜炎奈瑟球菌结合疫苗生产用菌株CMCC(B)29201和CMCC(B)29205株毒性低、抗原性和免疫原性良好,连续传代至30代次仍保持较低的毒性和较好的抗原性及免疫原性,纯化的A群和C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖质量符合质控要求.
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三种不同载体的C群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合疫苗比较研究
目的 通过3种不同载体即破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)与C群脑膜炎球菌荚膜多糖(GCMP)结合,经免疫小鼠后比较3种结合疫苗的免疫原性.方法 将GCMP以ADH作为间隔剂分别与TT、DT和rEPA等3种蛋白质载体结合形成GCMP-蛋白质结合疫苗,以GCMP和3种结合疫苗免疫NIH小鼠以研究在其体内的免疫原性.结果 GCMP和结合疫苗免疫NIH小鼠后,其血清ELISA结果显示多糖疫苗和结合疫苗均可诱生免疫应答,但使用GCMP免疫小鼠后仅能产生较低水平抗GCMP的IgG抗体,而用3种GCMP-蛋白质结合疫苗免疫小鼠后其血清中产生了较GCMP免疫显著增高的抗GCMp的IgG抗体,并且3种GCMP-蛋白质结合疫苗第2次、第3次免疫与初次免疫相比,IgG抗体水平均有显著升高(P＜0.001),表明GCMP-蛋白质结合疫苗具有免疫记忆和加强应答效应,且3种GCMP-蛋白质结合疫苗在小鼠体内产生的抗GCMP水平差异有统计学意义(P＜0.01).补体介导的血清抗体体外杀菌试验结果证明,3种GCMP-蛋白质结合疫苗免疫小鼠诱导的IgG抗体均比GCMP具有增强的体外杀菌活性.结论 经3种不同载体与GCMP结合后免疫小鼠均产生了比GCMP显著增强的免疫应答.比较研究表明,rEPA是实验中GCMP-蛋白质结合疫苗较好的备选载体.
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脑膜炎奈瑟菌A群荚膜多糖与B群外膜蛋白复合物偶联物的制备和免疫原性
目的 脑膜炎奈瑟菌(Nm)A群荚膜多糖与B群菌株3407或542852外膜蛋白复合物偶联,希望获得1种对A和B群Nm感染皆有预防效果,并可提高A群荚膜多糖对婴幼儿免疫力的偶联物.方法 用饱和硫酸铵沉淀细菌培养上清液,沉淀物再经Sephacryl S-300纯化获得外膜蛋白复合物.通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应将B群外膜蛋白复合物与A群荚膜多糖偶联.偶联物、未偶联的荚膜多糖、B群外膜蛋白复合物及A群荚膜多糖和B群外膜蛋白复合物简单混合物按相同程序免疫小鼠获得抗体,经ELISA、杀菌力试验和Western blotting测定了偶联物的免疫原性.结果 偶联物比未偶联的荚膜多糖或者荚膜多糖同B群外膜蛋白复合物简单混合抗原的免疫原性增强21～320倍;其中以B群3407菌株的外膜蛋白复合物与A群荚膜多糖偶联的效果更好.偶联物免疫血清不仅对A群代表菌株(29019)和B群菌株(3407,542852和29021)均有较强的杀菌活性,而且还对所试的具有不同菌型特征的其它8株B群菌株仍有较强的交叉反应性.Western blotting初步分析发现上述两种偶联物免疫的血清与各自的外膜蛋白复合物在相对分子质量约42×103、39×103和26×103处有相同的反应带,其中42×103左右的条带为1类外膜蛋白.结论 A群荚膜多糖与外膜蛋白复合物偶联后的偶联物对小鼠不仅具有很强的A和B群Nm的免疫原性,而且使ACPS的免疫原性也明显地增强了.
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肺炎链球菌荚膜多糖抗原活性的评价方法
目的：比较免疫双扩散法和速率散射比浊分析法在肺炎链球菌荚膜多糖抗原性评价方面的优劣。方法分别采用免疫双扩散法和速率散射比浊分析法检定来源于4个公司和美国ATCC的1型、6B型、9V型、10A型、14型和19A型肺炎链球菌荚膜多糖样品的抗原活性，同时比较肺炎链球菌免疫血清和仪器增益值对实验结果的影响。结果两种抗原活性检定方法都显示9V型4号样品的抗原活性缺失，其速率散射浊度信号值接近阴性对照；其余多糖样品均有沉淀线，速率散射浊度信号值高低不等；不同来源的肺炎链球菌抗血清和仪器增益值对速率散射比浊分析法的实验结果无明显干扰。结论速率散射比浊分析法能够定量分析各型肺炎链球菌荚膜多糖的抗原活性。
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猪链球菌2型毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用
猪链球菌2型是一种重要的人兽共患传染病,该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病,同时也是公共卫生防疫的重点[1-2].不同猪链球菌2型菌株的致病力不同,可分为高致病性毒株、低致病性毒株、不致病性毒株3种,这种致病力差异与各菌株的毒力因子直接相关,猪链球菌的毒力因子较为复杂,已知的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、荚膜多糖(CPS)、IgG结合蛋白、毒力相关序列、黏着素等,不同地区分离的猪链球菌菌株,其毒力因子出现的概率也不一样,尚缺乏统一的评价标准[3-7].
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NMR法测定A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量
目的:采用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术检测A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖(groups A,C,Y,W135 Neisseria meningococcal capsular polysaccharides,GAMP,GCMP,GYMP,GWMP)氧乙酰基含量.方法:对A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖样品进行溶解,离心,转移等处理步骤,采用核磁共振谱仪检测,并对检测参数D1,NS和计算标准进行优化使其满足定量检测要求.结果:确定的检测条件:D1值GAMP为18,GCMP,GYMP和GWMP为20;NS值均为128次,计算标准GAMP采用H-3和H-4与H1积分面积之比,GCMP采用H-7和H-8与H-3e积分面积之比,GYMP和GWMP采用H-7和H-9与H-3e积分面积之比.结论:NMR法简便、快速、准确,可用于检测A,C,Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量.
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A群脑膜炎球菌荚膜多糖化学结构核磁共振检测方法的建立
目的:建立基于核磁共振技术检测A群脑膜炎球菌荚膜多糖化学结构的方法.方法:对A群脑膜炎球菌荚膜多糖样品进行溶解,离心,转移等处理步骤,采用核磁共振谱仪检测,结果应用Topspin 3.0软件进行数据处理和结果分析.验证其特异性、重复性及中间精密性,并对其O-乙酰化程度和杂质进行分析.结果:A群脑膜炎球菌荚膜多糖样品经本实验建立的方法检测,通过水峰压制,空白组及氯化乙酰胆碱等检测结果显示方法具有良好的特异性;同一批次检测3次的结果具有较高的重复性;不同时期检测的结果表明方法的中间精密性良好;O-乙酰基含量符合WHO规定的低限度(≥61.5％),检测同一供试品的CV值均＜1％.结论:本研究建立的核磁共振检测法简便、快速、准确,检测A群脑膜炎球菌荚膜多糖具有极高的灵敏性、特异性、重复性和中间精密性,适用于疫苗生产研究中A群脑膜炎球菌荚膜多糖样品的定性结构鉴定.
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5型肺炎链球菌荚膜多糖与破伤风类毒素的结合及其影响因素探讨
目的:制备5型肺炎链球菌多糖与破伤风类毒素衍化物的结合物,探讨结合过程中多糖分子大小、多糖蛋白投入比、反应时间等因素对结合终产物的影响.方法:应用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸酯(CDAP)活化剪切后的5型肺炎球菌荚膜多糖,在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)作用下与连接了二酰乙二腈(ADH)的破伤风类毒素(TT)进行偶联反应,经分子筛层析纯化,得到5型肺炎链球菌多糖与破伤风类毒素的结合物,并检测其生化指标,免疫原性等.结果:剪切后的多糖免疫原性良好,其与TT的结合物在分子筛上可以很好分离；描述了多糖活化时CDAP的投入量,蛋白与多糖投入比,反应时间等对结合效率、结合物分子量、游离糖含量和结合物的多糖蛋白比影响.合成的结合物在免疫小鼠后,多糖特异性IgG抗体几何平均滴度(GMT)较多糖显著提高,显示免疫增强效应.结论:CDAP方法可以应用于PN5型肺炎链球菌荚膜多糖与破伤风类毒素结合疫苗的制备.
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依替米星联合左氧氟沙星对糖尿病足MRSA感染的疗效
目的 探讨依替米星联合左氧氟沙星对糖尿病足耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的治疗作用,并对MRSA荚膜多糖致病基因多态性进行初步研究.方法 选取2012年10月-2014年10月期间于杭州师范大学附属医院接受治疗的糖尿病足MRSA感染患者78例,采用随机数字表法分为对照组和实验组.对照组39例,其中男性20例,女性19例,年龄30 ～ 72岁,平均年龄(47.8±18.2)岁,采用左氧氟沙星进行治疗;实验组39例,其中男性20例,女性19例,年龄28 ～75岁,平均年龄(49.1±19.5)岁,采用硫酸依替米星联合左氧氟沙星治疗,2组患者治疗时间均为4周,采用Wagner分级法对患者疗效进行评定,比较2组患者糖尿病足治疗有效率,并且对其致病因素荚膜多糖中致病基因进行研究.结果 实验组临床总有效率显著高于对照组(P＜0.05),在治疗后28 d,创面细菌金黄色葡萄球菌阳性率实验组显著低于对照组(P＜0.05);荚膜多糖主要是通过保护细菌倍吞噬系统吞噬从而抵抗抗生素杀伤力,对患者创面细菌进行荚膜多糖基因PCR分析结果显示荚膜多糖致病基因主要以5型以及8型为主(61.5％).结论 依替米星联合左氧氟沙星对MRSA所致糖尿病足患者有较强的治疗作用,显著增加患者治疗有效率,其荚膜多糖基因主要足以荚膜多糖5型以及荚膜多糖8型为主.
关键词： 依替米星 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 糖尿病足感染 荚膜多糖 致病基因 -
发展粘膜免疫B族链球菌荚膜多糖结合物疫苗
育龄妇女直肠和阴道B族链球菌(GBS)带菌是引起新生儿侵袭性感染的主要原因.有效的疫苗预防应该能够诱导机体产生全身和粘膜局部两方面的免疫力.为了有效地预防新生儿GBS感染的发生,本项目制备了粘膜免疫的B族链球菌荚膜多糖(GBS CPS)结合物疫苗.它应该能够诱导机体产生全身(系统)和粘膜局部两方面的免疫力.
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春季慎防流脑
春暖花开的季节,也是流脑易流行的季节."流脑"是流行性脑脊髓膜炎的简称,其病原是脑膜炎奈瑟氏茵.此茵依其荚膜多糖的差别可分为13型,主要的流行茵为A、B、C、Y、W135型,90%的流脑是由A、B、C型引起的.
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现代检验诊断新技术(三十九)"流脑"的检验诊断
"流脑"是流行性脑脊髓膜炎的简称,其病原是脑膜炎奈瑟氏菌.此菌依其荚膜多糖的差别可分为13型,主要的流行菌为A,B,C,Y,W135型,90%的"流脑"是由A,B,C型引起的.我国今年的流行菌株为C型菌.此菌经呼吸道进入体内,突破血脑屏障进入脑内,引起急性脑脊髓膜炎.
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植物多糖的研究进展及保健功能
多糖广泛存在于植物、微生物(细菌和真菌)和海藻中,来源很广.其中研究较早且多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖,它在医药上主要用于疫苗生产.近几十年来,人们发现从植物中提取的多糖具有非常重要与特殊的生理活性.这些多糖参与了生命科学中细胞的各种活动,具有多种多样的生物学功能,如参与生物体的免疫调节功能,降血糖、降血脂、抗炎、抗疲劳、抗衰老等[1].目前人们已成功地从近百种植物中提取出了多糖并广泛地用于医药和保健食品的研究和开发中.现综述如下.
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兽疫链球菌荚膜多糖对免疫抑制鼠的抗氧化和免疫调节活性研究
目的 测定部分纯化的兽疫链球菌荚膜多糖(PCP)的抗氧化和免疫调节活性.方法 以注射用环磷酰胺(CY)造成免疫抑制鼠模型.结果 口服PCP诱导了免疫抑制鼠超氧化物歧化酶(SOD).谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性,提高了总抗氧化能力(TAOC)的水平.口服PCP后免疫抑制鼠的胸腺和脾脏指数明显增加,血清溶菌酶活性和迟发型超敏反应(DTH)引起的肿胀率也显著提高.结论 PCP对免疫抑制鼠具有免疫调节功能并改变CY诱导的氧化压力,是一种潜在的抗氧化剂和免疫调节剂.
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欧美开发的新肺炎球菌糖结合疫苗
肺炎球菌性肺炎作为流感感染的继发感染十分重要.特别是为了预防老年人肺炎,以菌体荚膜多糖为成分的疫苗于1977年在美国首次获得认可.肺炎球菌存在多种血清型,早获得认可的疫苗是14价疫苗,而在1988年23价的疫苗又获认可.日本23价疫苗于1988年获得认可,其使用量逐年上升,近年来约为20万支/年,疫苗主要用于老年人.
