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粘膜免疫与“肾虚膀胱热”理论相关性探讨
“肾虚膀胱热”是中医脏腑相关理论的重要组成部分，是祖国医学对淋证病因病机的主要概括。现代免疫学认为，粘膜免疫系统由粘膜局部的粘膜相关淋巴组织及免疫细胞共同组成，主要针对经粘膜表面进入的微生物产生应答，抵抗微生物对机体的侵袭。粘膜免疫在尿路感染的发生中发挥着重要作用。本文以“SIgA”和“归巢机制”为基点，探讨粘膜免疫与“肾虚膀胱热”理论相关性，以期更好地挖掘中医“肾虚膀胱热”理论的内涵。
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IL-5在非复制重组痘苗病毒中的表达及其对重组病毒免疫效果的影响
利用非复制型痘苗病毒表达载体pNEOCK11β75IL5和重组病毒RVJ123,通过两步重组构建了能同时表达IL-5和乙型肝炎病毒HBsAg的非复制型重组痘苗病毒RVJ123A11β75IL5.Southern-blot证实,痘苗病毒C-K片段间基因缺失的同时伴有IL-5基因的插入.鼻腔吸入分别免疫Balb/c小鼠和新西兰白兔,ELISPOT实验证实,免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgA抗体分泌细胞(ASC)数比对照组(RVJ123A11β75)增加约2倍,而同时小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAg IgG抗体分泌细胞(ASC)数与对照组无差别.可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其它分泌液样品中检测到抗乙型肝炎病毒HBsAg的特异性的IgA、IgG抗体,与对照组相比,IgA抗体阳转率及抗体滴度提高,而IgG则无差异.本实验说明:IL-5可在体内选择性地增强机体的粘膜IgA反应.提示非复制载体疫苗中,表达的该细胞因子可有效的增强疫苗的粘膜免疫反应,为粘膜疫苗的发展策略提供了新的途径.
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粘膜免疫戊型肝炎试验性疫苗的研究
采用原核表达的戊型肝炎病毒结构区基因(HEV ORF2)编码蛋白,与新型人用疫苗佐剂类MF59配制成试验性疫苗,通过粘膜免疫途径免疫实验小鼠,研究其产生粘膜免疫和体液免疫的效果.结果表明,通过滴鼻和灌胃两种粘膜免疫途径免疫BALB/c小鼠,均能诱导小鼠产生针对HEV ORF2试验性疫苗的血清IgG和IgA,血清IgG的抗体滴度为1:800～1:1600,血清IgA抗体滴度为1:100～1:200.对免疫小鼠血清中IgG的动态观察表明,血清抗体可持续存在至少6个月以上.比较类MF59佐剂和传统铝盐佐剂经注射免疫所诱导产生的血清IgG抗体滴度,发现类MF59佐剂可有效增强HEV ORF2重组蛋白的免疫原性4倍左右.类MF59佐剂可诱导粘膜免疫反应,在肠道粘膜部位产生SIgA,滴度为1:100.这些结果为新型戊型肝炎病毒基因工程重组疫苗的研制提供了一条新的思路.
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表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建
用RT-PCR方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到5型腺病毒载体质粒pAd5C中.用此质粒与EcoRI酶切回收的5型腺病毒基因组大片段共转染293细胞,通过PCR初步筛选得到重组病毒.SDS-PAGE电泳、Western blot证明重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白.此重组病毒经滴鼻免疫Balb/C小鼠,ELISA实验证明能诱导小鼠产生针对流感病毒的循环抗体IgG和分泌型抗体IgA.本实验证明,利用E3区缺失的5型腺病毒载体可以用来表达流感病毒血凝素抗原,重组抗原具有良好的免疫原性,有可能发展成为基因工程流感疫苗.
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核酸疫苗VR1012/Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的研究
目的探讨日本血吸虫核酸疫苗VR1012/Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力. 方法将实验小鼠随机分为5组,每组12只.A组为单磷脂(MPL)组,B组为VR1012组,C组VR1012+ MPL组,D组为VR1012/Sj31组,E组为VR1012/Sj 31 + MPL组.滴鼻免疫.在第3次免疫后2周,每只鼠经腹部感染40±1条尾蚴,45 d后宰杀,观察减虫率和减卵率.在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血并收集粪便,ELISA检测血清内特异性IgA、IgG及粪内sIgA水平. 结果与对照组相比,VR1012/Sj 31及VR1012/Sj 31加MPL滴鼻免疫均可引起小鼠血清IgG、IgA和粪内sIgA升高,且VR1012/Sj 31加佐剂滴鼻免疫组抗体的增幅>不加佐剂组.VR1012/Sj31和 VR1012/Sj31加MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为21.70%和28.82%,减卵率分别为27.98% 和40.72%.二者的减虫率差异无显著性(P>0.05),但减卵率后者显著高于前者(P<0.05). 结论 VR1012/Sj31滴鼻免疫可引起小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗攻击感染的免疫保护力.
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致敏IEL过继转移诱导抗弓形虫感染的机制
目的分离供体鼠感染弓形虫后不同时间点的小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte, IEL)并过继转移,研究其诱导受体鼠抗弓形虫感染作用及其机制. 方法 BALB/c小鼠经口感染弓形虫速殖子5×104个/只,对照组未感染,作为供体提供IEL.同品系小鼠36只为受体鼠,分为6组,每组6只,经尾静脉分别接受分离自供体鼠感染弓形虫后第7(IEL7组)、9(IEL9组)、11(IEL11组)、13(IEL13组)、15 d(IEL15组)的致敏IEL或未致敏(IEL0组,即对照组)的IEL 3×105 /0.2 ml·只.各组小鼠过继转移后第4 d,用弓形虫速殖子灌胃攻击,攻击后第13 d分离纯化脑、肺、脾组织内速殖子并计数,测定小肠Peyer's Patch(PP)CD4+、CD8+T细胞亚群水平. 结果致敏IEL过继免疫可使受体鼠脑、肺、脾组织内速殖子数显著减少,接受致敏后第13 d IEL的小鼠组织内速殖子数减少为显著(Ρ<0.01),与IEL0组相比,脑、肺和脾组织内速殖子数分别减少81.13%、58.43%和70.97%;同时,小肠PP结CD4+T细胞增多,CD4+/CD8+比值增高(Ρ<0.01). 结论过继转移致敏IEL能显著提高受体鼠的抗弓形虫感染能力,且保护作用同致敏时间关系密切,以感染后13 d分离的致敏IEL保护性强.
关键词： 弓形虫 粘膜免疫 过继转移 Peyer's Patch 小鼠 -
经口感染弓形虫诱导的小鼠肠道粘膜T细胞亚群变化
目的研究经口感染弓形虫速殖子小鼠肠道粘膜组织诱导部位与效应部位T细胞亚群的变化,探讨肠道粘膜免疫应答机制.方法将6～7周龄BALB/c小鼠100只随机分为对照组和感染组.感染组灌胃接种RH株弓形虫速殖子5×104个/只,对照组给予等体积PBS.于感染后第2、4、6、8、10 d分别处死小鼠,分离Peyer's patches(PP结)、肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞、小肠上皮内淋巴细胞(IEL),用免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群.结果感染组小鼠PP结CD4+T细胞有随感染天数增加呈升高趋势,第6、8、10 d显著高于对照组(P<0.01);CD8+T细胞亦有增高趋势,但与对照组相比差异无显著性(P＞0.05);CD4+/CD8+比值第6 d起增高(P<0.05),第8 d大(P<0.01),第10d回落(P<0.05).MLN中T细胞亚群有较弱增高趋势,无统计学意义(P＞0.05).IEL CD4+、CD8+T细胞在第6、8、10 d均增高,其中CD8+T细胞增高显著(P<0.01);CD4+/CD8+比值第6 d开始下降,两组间差异有显著性(P<0.05).结论诱导部位PP结CD4+T细胞明显增高,诱导对弓形虫抗原的处理、提呈作用;效应部位IEL CD8+T细胞增殖明显,在清除虫体的过程中起主导作用.
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小鼠腹水中弓形虫排泄分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的免疫应答
目的 观察弓形虫感染小鼠腹水中分离的排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigens,ESA)鼻内免疫小鼠对不同粘膜部位和系统的免疫效应.方法 将5～6周龄BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,实验组分别用从感染弓形虫后24、48、72 h小鼠腹水中提取的ESA 20 μg/只鼻内免疫小鼠2次,间隔2周;对照组用20 μl/只PBS滴鼻.观察小鼠健康和死亡情况,记录体重.末次免疫后第3周处死小鼠,计数PP(Peyer's patches)个数;分离PP淋巴细胞、脾淋巴细胞、小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)及肠系膜淋巴结细胞(mesenteric lymph node lymphocyte,MLNL)并计数.眼眶采血和收集直肠内粪便,ELISA检测血清特异性IgG水平及粪便sIgA.结果 72 h ESA组小鼠免疫后健康状况较差,体重逐渐降低,死亡4只;其他组小鼠体重仍呈增高趋势.各实验组小鼠IEL、MLNL、脾淋巴细胞以及PP淋巴细胞的增殖活性均高于对照组(P＜0.05),72 h和48 h ESA组高于24 h ESA组(P＜0.01).免疫后第3周,各实验组小鼠血清IgG、粪便sIgA水平均高于对照组(P＜0.05),72 h和48 h ESA组高于24 h ESA组(P＜0.01).结论感染后不同时间提取的腹水弓形虫ESA鼻内免疫小鼠均可诱导不同粘膜部位及系统特异性的免疫应答,48 h ESA的免疫效果好.
关键词： 弓形虫 排泄-分泌抗原(ESA) 粘膜免疫 鼻内免疫 粘膜疫苗 -
经口灌胃感染弓形虫诱导的BALB/c小鼠肠道粘膜免疫应答
目的 研究BALB/c小鼠经口感染(灌胃)弓形虫速殖子后肠液IgA抗体分泌的动态变化及肠道粘膜组织诱导与效应部位T淋巴细胞亚群的变化,探讨肠道粘膜免疫应答机制.方法 将6～8周龄BALB/c小鼠100只随机分为对照组和感染组.感染组经口感染(灌胃)弓形虫RH株速殖子5×104个/只,对照组给予等量PBS.于感染后第2、4、6、8、10、13、16、19、22、25 d处死小鼠,每次5只.收集各时间点肠道冲洗液,用ELISA法测定肠液IgA水平;分离第2、4、6、8、10 d Peyer's Patches(PP)、肠系膜淋巴结(MLN)及小肠上皮内淋巴细胞(IEL),制备悬液并涂片,用免疫细胞化学方法测定CD4+、CD8+T细胞亚群水平.结果 在感染后第4、6、8、13 d实验组的肠液IgA抗体分泌显著高于对照组(P＜0.01).实验组PP结CD4+T细胞水平在6、8、10 d显著高于对照组(P＜0.05);CD8+T细胞水平与对照组无显著性差异,CD4+/CD8+比值在6、8、10 d显著升高(P＜0.05).肠系膜淋巴结的CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值各时间点均无显著变化.感染后第6、8、10 d,效应部位小肠上皮内淋巴细胞CD8+T细胞增高显著(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值倒置(P＜0.05).结论 经口感染弓形虫BALB/c小鼠的肠道产生高水平的IgA抗体,作为局部首道屏障,发挥着重要的抗虫作用.诱导部位PP CD4+T细胞水平明显增高,诱导对弓形虫抗原的处理提呈作用;效应部位IEL CD8+T细胞亚群增殖明显,在清除虫体的过程中起主导作用.
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白念珠菌在肠腔中的增殖与局部IgA抗体分泌的关系
目的 观察白念珠菌(白念菌)在肠腔内增殖与局部粘膜免疫反应的关系.方法 采用无特殊病原菌动物经口喂入白念菌,在不同时相处死后,观察肠内白念菌总数及肠粘膜表面白念菌粘附数量;取肠系膜淋巴结做白念菌选择培养,观察移位体内发生率;采用Brdu体内掺入显示局部粘膜淋巴细胞的增殖情况;流式细胞计数潘伊尔氏结细胞表面IgA(SmIgA)阳性率;免疫组化染色后计数固有层中IgA浆细胞数量变化;ELISA法测定肠粘液中特异抗白念菌IgA含量.结果 肠内白念菌总量及粘膜表面粘附数量随给菌后时间延长而明显下降;移位主要发生于给菌后早期;给菌后固有层淋巴细胞增殖活跃,分泌IgA浆细胞数量明显增加;粘液层中特异抗白念菌IgA含量在给菌后上升明显.结论 带菌动物首次白念菌肠内给入后以固有层中淋巴细胞反应为主,增殖及分化均增加;白念菌总量和粘附数量减少与局部粘膜免疫反应及特异IgA抗体含量上升的关系十分密切.
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伤寒活疫苗Ty21a免疫相关新基因的克隆及其组织分布
粘膜免疫在机体的免疫防御系统中起着重要的作用.寻找粘膜免疫防御相关的分子,对于揭示粘膜免疫的规律具有重要的意义.在通过抑制消减杂交,建立cDNA消减文库的过程中,发现了几条在Ty21a免疫后基因表达发生改变的新的ESTs.为了揭示这些ESTs对应的基因在粘膜免疫中的作用,我们利用RACE-PCR技术扩增了其中1条EST对应基因的全长.
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表达HPV6b L1-E7嵌合蛋白的减毒沙门菌诱导小鼠免疫应答
目的探讨表达人乳头状瘤病毒6b型(HPV6b)L1-E7嵌合蛋白的减毒沙门菌诱导小鼠粘膜及系统免疫反应的可行性. 方法对重组减毒沙门菌S.BRD509/pTETnir15-6bL1E7体外厌氧诱导其表达,Western blot方法鉴定表达的 L1-E7蛋白.此重组沙门菌经滴鼻和口服联合粘膜免疫BALB/c小鼠,采用ELISA方法及足垫肿胀试验分别检测免疫小鼠血清及阴道冲洗液中特异性抗体和DTH反应. 结果 Western blot分析显示,重组沙门菌在预计相对分子质量(Mr)56×103处有特异染色带,提示此重组沙门菌能表达特异的HPV6bL1-E7蛋白.ELISA检测结果表明实验组小鼠阴道冲洗液中HPV6b L1特异性sIgA显著升高,和对照组比较两者差异有显著性(P＜0.01),但小鼠血清中HPV6b L1 IgG抗体无明显变化,实验组和对照组两者差异无显著性.DTH 结果显示:与对照组比较,实验组小鼠接受HPV6b L1-E7抗原刺激后产生明显阳性反应,提示重组沙门菌免疫小鼠产生了针对HPV6b L1-E7抗原的特异性细胞免疫反应. 结论构建的重组减毒沙门菌S.BRD509/pTETnir15-6bL1E7可激发有效的粘膜免疫及细胞免疫反应,为进一步研制新型HPV粘膜疫苗奠定了实验基础.
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阿尔茨海默病患者嗅粘膜免疫病理观察
目前阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)的临床诊断主要依赖临床神经心理学检查,通过排除法得出.国外报道嗅粘膜(olfactory mucosa, OM)免疫病理染色可能成为AD诊断的客观指标,为此我们对OM免疫病理特点及其对AD的临床诊断价值进行了探讨.
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补充双歧杆菌可促进烫伤大鼠肠道sIgA合成与分泌
目的:探讨严重烫伤后补充双歧杆菌与肠道sIgA合成、分泌的关系.方法:Wistar大鼠70只随机分为烫伤对照组(BC,n=30)、烫伤治疗组(BT,n=30)、假伤组(NC,n=10).BT组伤后灌胃双歧杆菌悬液(5×109cfu/ml),1.5ml,2/d.检测大鼠细菌及内毒素移位、膜菌群中双歧杆菌量、肠粘液sIgA浓度及肠道浆细胞sIgA表达情况等.结果:(1)伤后3d,BC组与BT组细菌移位率分别为42%和16%(P=0.004),伤后5d分别为30%和8%(P=0.002).(2)伤后大鼠盲肠膜菌群中双歧杆菌减少约10～60倍;灌胃双歧杆菌悬液后肠道双歧杆菌明显增多.(3)BC组肠粘液sIgA平均减少约30%,伤后3d达低;BT组3d伤后基本恢复正常.伤后回肠粘膜下固有层浆细胞sIgA表达减弱,补充双歧杆菌后sIgA表达显著增强,5d接近NC组.(4)膜菌群中双歧杆菌量与肠粘液sIgA浓度呈显著正相关.结论:严重烫伤后肠道sIgA产生明显受抑制,其改变与膜菌群中双歧杆菌减少有关,补充外源性双歧杆菌可促进肠道sIgA合成与分泌.
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烧伤后肠粘膜免疫组织细胞增殖分化的研究
目的:对烧伤后肠粘膜免疫组织潘氏结内淋巴细胞(PPL)膜IgA转型以及肠固有层的淋巴细胞(LPL)体外增殖情况进行观察,为提高粘膜免疫屏障水平、预防肠源性感染的发生提供依据.方法:无特殊病原菌(SPF)小鼠,随机分为对照组(10只),烧伤组(10只).烧伤组致以20%TBSAⅢ度烧伤,于伤后3d与对照组同时活杀,用免疫组化染色观察肠固有层中IgA型浆细胞;PP中淋巴细胞表面IgA流式细胞计数;烧伤后LP淋巴细胞体外增殖检测;肠组织中IL-6 ELISA测定.结果:PP中淋巴细胞表面IgA阳性率烧伤后3d低于正常对照组;烧伤后LP中IgA浆细胞数明显少于伤前的水平;烧伤后动物的LP中淋巴细胞体外增殖明显下降;烧伤后3d肠组织中IL-6水平与正常对照组无显著差别.结论:烧伤后抑制肠粘膜免疫组织淋巴细胞自身的增殖、分化,导致粘膜免疫屏障水平降低.
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粘膜免疫与艾滋病的预防和控制
粘膜是大多数病原微生物侵入机体的门户.粘膜免疫系统的特异和天然免疫机制阻止了绝大部分粘膜感染的发生.世界范围内约有90%的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染是通过粘膜发生的.与HIV-1粘膜传播有关的粘膜包括泌尿生殖系统和消化系统粘膜.消化道粘膜不仅在HIV-1侵入机体的过程中作为病毒入侵的门户,而且在HIV-1感染后为病毒的繁殖提供场所.HIV-1感染导致粘膜中CD4+ T淋巴细胞不断减少,可能在HIV-1感染后的病理过程中发挥重要作用.通过杀微生物制品或艾滋病疫苗阻断或限制HIV-1跨越粘膜屏障,可能是控制HIV/AIDS粘膜传播的有效的生物学干预措施.
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经涎腺投递基因疫苗的研究进展
基因疫苗能够诱导机体产生较强和持久的免疫应答,制作成本低,运输、储存和使用方便,具有潜在应用价值.常规基因免疫途径有肌肉注射、皮内注射、静脉内注射、腹腔内注射、皮下注射、粘膜免疫等.涎腺作为外分泌腺体,其解剖特点特别适用于基因疫苗的投递.经涎腺投递基因疫苗是近些年涌现出的新的免疫方式,具有免疫原性强、安全性好等优点.经涎腺投递的基因疫苗不仅能够诱导体液免疫和细胞免疫,还能诱导强烈的黏膜免疫.
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肠道菌群与儿童免疫
人体内存在数量庞大、结构复杂的正常肠道菌群,其在长期的历史进化过程中形成了一个动态的微生态系统.像是一道屏障,保护宿主的健康,维持人体肠道正常生理功能.肠壁内存在为数众多、功能强大的淋巴细胞,以肠粘膜为界,两者相互作用,相互制约,处于动态平衡状态.正常肠道菌群在促进免疫系统发育,维持正常免疫功能,协同拮抗病原菌入侵方面,发挥着重要作用.同时,免疫系统对肠道菌群又有制约和调控作用,如对正常菌表现为免疫耐受,对病原菌表现为免疫排斥,一旦二者间的平衡被破坏,就会导致疾病.
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发展粘膜免疫B族链球菌荚膜多糖结合物疫苗
育龄妇女直肠和阴道B族链球菌(GBS)带菌是引起新生儿侵袭性感染的主要原因.有效的疫苗预防应该能够诱导机体产生全身和粘膜局部两方面的免疫力.为了有效地预防新生儿GBS感染的发生,本项目制备了粘膜免疫的B族链球菌荚膜多糖(GBS CPS)结合物疫苗.它应该能够诱导机体产生全身(系统)和粘膜局部两方面的免疫力.
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营养与病毒感染性疾病动物模型
当前新现病毒性疾病的研究大的"瓶颈"在于没有胜任动物模型.建立在非人灵长类动物基础上的模型,虽然可以部分复制人类疾病特征,但其经济性欠佳且与动物权益的保护有所冲突;而啮齿类动物对新现病毒的易感性往往较低,也不能很好地复制人类疾病.本文对营养、免疫及疾病易感性关系研究的进展进行文献回顾,以发现解决当前难题的线索.
