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大肠杆菌O157:H7抗菌药物敏感性研究
为了解E.Coli O157:H7对抗菌药物的敏感性及其耐药谱的差异,我们选择了常见的19种抗生素,对1999年分离到的89株O157:H7进行药敏试验.结果显示O157:H7对氨基甙类、头孢类、喹诺酮类、呋喃类的实验药物、多肽类的多粘菌素B以及氯霉素的敏感率高,基本在90%以上.在宿主动物中家禽类的菌株耐药率大于家畜类,家畜类宿主中猪的菌株耐药率大于牛、羊.无毒力基因菌株对抗生素的耐药率高于有毒力基因的菌株(P＜0.05).样本来源不同和基因型别不同的耐药结果均显示菌株对抗生素的耐药情况与其是否携带有毒力基因有关.
关键词： E.Coli O157 H7 药物敏感试验 -
浙江省检出带毒力基因的人源性肠出血性大肠杆菌O157:H7
目的了解肠出血性大肠杆菌O157:H7在浙江省人群中的感染情况和菌型分布特征,制定相应的防治对策.方法5～10月份肠道传染病高发季节,在浙江省各地(市)肠道门诊采集腹泻病人粪便,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因.结果1998年开始至今的人群监测中,共检出2株无毒力的肠出血性大肠杆菌O157:H7.PCR毒力基因检测,SLT2和Hly阳性,SLT1阴性.结论与以往不同,此次分离到带有毒力基因的人源性肠出血性大肠杆菌O157:H7,说明浙江省O157:H7在菌型特征方面发生了变化,对人群健康构成了更大的威胁.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 毒力 分离 -
使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究
目的 探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法.方法 针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157:H7和非O157:H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较.同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的实际运用价值进行评估.结果 LAMP法可以在1h内完成检测工作.LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%.结论 LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高.LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157:H7样本.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 环介导等温扩增 rfbE基因 fliC基因 -
HIV-1 gp120对鼠海马长时程增强效应的影响
为了探讨人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响,应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),研究了gp120对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-term potentiation,LTP)的影响.结果发现:gp120对大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用,对其基础EPSP没有影响,而且这种抑制效应随着gp120浓度增大而增强,即具有剂量依赖性.PKA/PKC蛋白激酶抑制剂H7可以反转这种抑制效应.提示:gp120可能是通过抑制海马CA1区的LTP而参与艾滋病相关性痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的形成.
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肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染分子流行病学方法研究进展
肠出血性大肠埃希菌O157:H7严重危害着人类的健康,已成为世界范围内的公共卫生问题.随着分子生物学的发展,质粒图谱分析,脉冲场凝胶电泳分型、随机扩增多态性分析、限制性片段长度多态性分析、扩增片段长度多态性分析、多位点可变数量串联重复序列分析、多位点测序分型等技术被先后应用于O157:H7感染的分子流行病学研究,本文对其研究进展进行了简要的综述.
关键词： 肠出血性大肠埃希菌O157 H7 分子流行病学 分子分型 综述 -
肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA-Stx2B融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究
目的 重组表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA与Stx2B融合蛋白,并对其生物学活性进行初步研究.方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因及stx2B基因,两基因通过连接子(linker)相连,T/A法克隆,克隆至pET-28a(+)表达载体上,转化宿主细胞E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,免疫印迹分析免疫反应性.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性,然后对免疫小鼠进行O157活菌攻毒试验和O157超声上清致死保护试验.结果 构建的espA-stx2B融合基因片段的测序结果 与理论预测值完全一致.融合蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约40%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与EspA和Stx2B抗体发生抗原抗体反应.免疫小鼠其特异性抗体阳转率达100%,EspA和Stx2B抗体的几何平均滴度(GMT)分别增长了124.30倍和58.49倍.免疫小鼠O157活菌攻毒保护试验免疫后排菌时间和排菌量与对照组相比并没有明显改变,O157菌超声上清致死保护试验免疫组存活率为10/15,对照组全部死亡.结论 在E. coli中高效表达了EspA-Stx2B融合蛋白,此融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白免疫小鼠并不能降低细菌在小鼠胃肠道的黏附与定植,但却起到明显的免疫保护作用,保护率为66.7%(10/15).
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新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化
目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白.结果:构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白.纯化后目的蛋白的纯度90%.结论:得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.
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大肠杆菌O157:H7 EDL933w z3672基因缺失突变体的构建
目的:构建EHEC O157:H7 EDL933w z3672基因缺失突变体.方法:根据已知的O157:H7 EDL933基因组全序列,采用pKOBEG介导的Red重组系统,筛选卡那霉素抗性基因替换z3672基因的阳性克隆,然后FLP位点特异性重组去除两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因,后通过PCR和测序手段证实.结果:获得了z3672基因缺失而且不含有卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株.结论:为进一步研究O157:H7的致病机制奠定了基础.
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肠出血性大肠埃希菌O157:H7的分布及特征
目的 了解H市外环境(食品、生活污水及菜地土壤)中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的分布与特性.方法 用免疫磁珠富集法进行O157:H7分离;按<全国食品污染物监测相关实验室手册>(细菌学部分)及相关国家标准鉴定分离菌株;标准血清分型;PCR法测定菌株SLT1,8LT2,ereA,hly毒素基因;纸片琼脂扩散(K-B)法测定菌株耐药性.结果 自H市外环境标本(食品、生活污水、菜地土壤)检出O157:H7共15株,检出率1.42%～4.34%,鸡肉与生活污水检出率高;农贸市场食物中O157:H7的检出率(2.25%)高于超市(0.56%);它们中有93.33%(14/15)是携带8LT1、8LT2、eae、hly毒力基因的高致病菌株;食源性O157:H7耐药性严重,耐药菌株多,仅对哌拉西林、亚胺培南敏感.结论 H市外环境有O157:H7分布,且检出的多是商致病性强毒菌株,应警惕其流行造成感染的潜在危险.
关键词： 大肠埃希菌 食源性致病菌 肠出血大肠埃希菌O157 H7 -
肉制品中沙门菌和大肠杆菌0157:H7的检测与体会
章丘市疾控中心中心实验室于2006年12月通过了国家实验室认可.2007年参加了由中国合格评定国家认可委员会(CNAS)组织的肉制品中沙门菌和大肠杆菌0157:H7检测能力验证.能力验证是认可机构和管理机构判定实验室能力的重要技术手段,也是实验室内部质量控制的补充措施.
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抑制或拮抗内源性bFGF活性对肠缺血再灌注所致肠、肝、肾功能的影响
目的:观察抑制或拮抗内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对肠缺血再灌注所致肠、肝、肾功能的影响.方法:96只大鼠分成bFGF抗体预处理、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶抑制剂H7预处理以及生理盐水对照3组,肠系膜上动脉根部用微血管夹夹闭45分钟之后放松血管夹形成再灌注.另6只作为正常对照(假手术组).分别于伤后即刻、2、6、24和48小时将动物活杀,取血检测肝、肾功能以及二胺氧化酶(DAO)变化;取肠、肝、肾组织进行形态学观察.结果:与假手术组相比,3组动物血浆肝、肾以及肠道损伤指标均明显升高,其中伤后2和6小时bFGF抗体组、H7组以及生理盐水对照组动物血浆丙氨酸转氨酶(ALT)分别比对照组平均增加2.5至3.5倍(P<0.05或P<0.01);血浆DAO变化及病理学结果均提示伤后2和6小时3组动物肠屏障功能显著破坏.结论:抑制或拮抗内源性bFGF活性将进一步加重缺血再灌注所致肠、肝、肾损伤,其主要作用环节是影响了bFGF与受体的结合以及随之发生的信号传导.
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鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选
目的 构建鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体.方法 用EHECO157:H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠.取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(κ和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157:H7Six2的Fab噬菌体抗体库.以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHEC O157:H7 Stx2的特异性Fab抗体.Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析.结果 构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出 3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应.基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨幕酸序列同源性分别为98.5%和99.6%.结论 已成功构建了鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHEC O157:H7 Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础.
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EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性
目的 在原核表达系统巾表达肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测.方法 PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基凶,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+).espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达.以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的 蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果.通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用.结果 重霍延伸PCR方法扩增出1 319 bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的 蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%.两种温度下,目的 蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%.Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应.融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157:H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应.融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%.免疫小鼠血清町以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用.结论 已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHEC O157:H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础.
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五重荧光定量RT-PCR法检测甲型流感病毒
目的 建立一种五重荧光定量RT-PCR检测并鉴别流感病毒A(Flu A)及血凝素H3、H5、H7基因亚型的方法.方法 以人细胞核糖核酸酶P(RNase P)基因为内参照,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针.构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,利用不同来源的呼吸道病毒样本进行特异性分析.结果 该法检测Flu A、H3、H5、H7以及RNase P质粒标准品的灵敏度均达102 copies/mL,特异性达100％,各对引物和探针仅检测出相应的病毒,未有交叉反应,变异系数(CV)≤1.99％.结论 建立的五重荧光定量RT-PCR法灵敏度、特异性高,重复性好,可用于检测出多种甲型流感亚型,对甲型流感病毒不同亚型早期诊断具有一定的价值.
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肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素2B亚基的表达
目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质.方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx28的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E. coli BL-21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot (WB)分析重组蛋白生物活性.结果:PCR扩增stx2b基因约220bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应.结论:成功克隆EHEC O157:H7 stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157:H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础.
关键词： 肠出血性大肠杆菌P157 H7 志贺样毒素2B亚基 克隆表达 -
链霉素及H7对机械牵张离体心肌HIF-1α、VEGF的影响及机制探讨
目的 研究链霉素及H7对机械牵张大鼠心肌组织低氧诱导分子-1α和血管内皮细胞生长因子表达的影响,并探讨二者在其中的作用机制.方法 采用大鼠离体灌流心脏模型,膨胀左心室30 min ,RT-PCR法检测左室心肌细胞HIF-1α、VEGF mRNA的表达,免疫组化观察二者在心肌细胞中定位,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达,利用链霉素作为牵张敏感离子通道(SACs) 阻断剂研究SACs和PKC抑制剂H7在其中的可能作用.结果 与不牵张组HIF-1α和VEGF mRNA无表达的比较,牵张可以明显增加HIF-1α和VEGF mRNA的表达(P＜0.05或P＜0.01);而链霉素、H7可以明显减少HIF-1α和VEGF mRNA的表达(P＜0.05);但是二者不能完全抑制急性牵张刺激激活的HIF-1α和VEGF mRNA水平升高(P＜0.05), HIF-1α和VEGF在胞质和胞核中均有表达,并检测到HIF-1α蛋白表达.结论 链霉素、H7对膨胀左室致HIF-1α、VEGF表达有明显抑制作用,提示心室膨胀经SACs-PKC-激活胞内信号诱导HIF-1α、VEGF表达.同时链霉素并不能完全抑制HIF-1α、VEGF表达,提示膨胀心室致HIF-1α、VEGF表达进而引起心室肥厚尚有其他传导途径,仍需进一步研究.
关键词： 低氧诱导因子-1α 血管内皮细胞生长因子 链霉素 H7 牵张敏感离子通道 -
大肠杆菌O157:H7 VT2毒素基因的克隆及测序
目的克隆出血性大肠杆菌O157:H7 的VT2毒素基因. 方法利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157:H7染色体基因组中扩增出VT2毒素基因,并连接至pGEM-T载体上,构建重组质粒pGVT2并进行序列测定.结果与结论酶切分析表明重组质粒含有VT2 毒素基因,核苷酸序列分析表明,其序列与GenBank上O157:H7的VT2毒素基因一致.
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2007年浙江省衢州地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7感染状况
目的:了解2007年浙江省衢州地区产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7在动物中的分布情况及其耐药性、PFGE分型及毒力基因携带状况.方法:按全国O157:H7监测方案于5～10月份肠道传染病高发季节,在衢州地区采集各种动物粪便/肛拭,用免疫磁珠富集后进行O157:H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O、H抗原及志贺样毒素(SLT1和SLT2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因.用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,分析分离所得菌株的耐药状况.结果:共监测动物粪便标本300份,分离得产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7菌株16株,分离率为5.33%.16株O157:H7菌株,毒力基因Hly、eaeA、SLT2均阳性,SLT1均阴性.脉冲场凝胶电泳分型显示,16株O157:H7菌株可分2个PFGE基因型,型间差异较小.耐药性分析显示这些菌株对红霉素、利福平的耐药率高,达100.0%,对其他受试抗生素均敏感.结论:该地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7带菌率较高,所分离菌株主要携带SLT2基因,因此推测该地区存在发生产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7感染暴发或流行的潜在危险,需增加对动物源性O157:H7的监测力度.
关键词： 产志贺毒素大肠埃希菌O157 H7 毒力基因 PFGE 监测 -
肠出血性大肠埃希菌O157:H7及其质粒O157的研究进展
致病性大肠埃希菌根据毒力性质、病理机制、临床综合征及不同的血清分型被分成肠毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和扩散粘附性大肠埃希菌(DAEC)6种.肠出血性大肠埃希菌(entero-hemorrhaagic Escherichia coli, EHEC)感染性腹泻是迄今世界范围内的公共卫生问题之一,其主要血清型O157:H7(以下简称E.coli O157: H7)是产志贺氏毒素大肠埃希菌(STEC)的一种亚型,产生一种或多种志贺氏毒素,诱导A/E损害.
关键词： 肠出血性大肠埃希菌O157 H7 质粒pO157 -
A Primary Test of EHEC O104:H4and EHEC O157:H7in Certain Kinds of Food in Wuhan,China
Objective:This paper provided preliminary description of food contamination derived from Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)O104:H4 and EHEC O157:H7 in Wuhan in June 2011.Methods:47 food samples,including vegetables and meat,were subjectively sampled from some restaurants.PCR assays were used to detect EHEC O104:H4 and EHEC O157:H7.Results:The PCR results showed that none of the samples were positive for either EHEC O104:H4 or EHEC O 157:H7.Conclusion:Although large outbreaks of gastroenteritis and the hemolytic uremic syndrome caused by EHEC O104:H4 had occurred in some European countries,China has had few outbreaks associated with EHEC O104:H4.This shows that food supply is relatively safe in China.Nevertheless,many ongoing problems of food safety in China are still not solved showing the necessity of further studies on food safety.
关键词： EHEC O104 H4 EHEC O157 H7 Food Safety
