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大肠埃希菌O157:H7 Tir基因的生物信息学分析
目的 扩增和测序肠出血型大肠埃希菌O157:H7 tir基因,利用生物信息学预测分析其结构和功能特征.以探讨Tir作为疫苗候选抗原的可能性.方法 利用PCR技术扩增咖基因并测序,应用生物信息学网站在线分析工具和vector NTI suite软件分析Tir蛋白结构和生物学功能,预测B细胞抗原表位.结果 该基因全长1 674 bp,编码558个氨基酸,蛋白质总体亲水性高,有稳定的理化性质.含有3个结构和功能域,两段穿膜结构,多个磷酸化位点,预测20个B细胞线性表位.结论 Tir毒力因子是很有前景的疫苗候选抗原,为肠出血型大肠埃希菌O157:H7的疫苗研究提供了理论依据.
关键词： 出血型大肠埃希菌O157 H7 转位紧密粘附素受体 生物信息学 -
肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究
目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.
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实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157:H7
目的 建立改良分子信标一双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断.方法 根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157:H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标一双重实时PCR检测体系.结果 双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157:H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰.对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性.其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR阳性.其中26份大肠杆菌O157:H7培养阳性.从样品处理到检测结果仅需要时间2h～1d.结论 改良分子信标一多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
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建立禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR检测方法
目的 建立高致病性禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR方法.方法 根据禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)HA-H7基因和HA-H9基因分别设计特异AIV H7和H9亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等.结果 经优化反应体系和反应条件后,AIV H7试剂和AIV H9试剂的敏感性达到1×10~(4.67) EID_(50)和1×10~(3.80) EID_(50)水平,特异性与细胞培养敏感性类似;批内和批间精密度Ct值的CV值均远小于10%,可重复性良好.结论 本项目研制的AIV H7和H9亚型的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感H7和H9亚型疫情和人类疑似禽流感病例中检测使用.
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肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化
目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺样毒素A亚单位(Shiga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westen blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2a基因约950bp;原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%.结论EHEC O157:H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157:H7菌的感染机制奠定基础.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 毒素A亚单位 表达 纯化 -
郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染监测
[目的]2005年监测郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况及病原分布特点,为各级卫生行政部门制订新发传染病防治措施,提供基础疫情资料.[方法]监测标本用免疫磁珠集菌方法(IMS)做病原学分离培养、毒力基因检测用多重PCR方法、药敏试验用(K-B)常规方法.[结果]腹泻病人标本185份,大肠杆菌O157:H7检出阳性4份.外环境标本588份,检出大肠杆菌O157:H7阳性20份.用多重PCR方法做毒力基因检测,有6份家畜家禽阳性标本中检出O157:H7毒力基因(Stx2、eaeA、HIyA)为阳性.药敏试验24株肠出血性大肠杆菌O157:H7对8种抗菌药物敏感率为95%以上,对新生霉素100%耐药,其余7种对抗菌药物敏感程度各有差异.[结论]郑州市有散在的大肠杆菌O157:H7感染的病人及动物疫点.奶牛和波尔山羊是大肠杆菌O157:H7动物宿主.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 监测 免疫磁珠集菌法(IMS) 多重PCR法 药敏试验 -
2015年广州市3447份外环境标本高致病性禽流感病毒监测结果分析
目的 分析2015年广州市禽类市场H5和H7高致病性禽流感病毒的污染情况,为人禽流感防控提供基础数据.方法 按随机抽样的方法,对广州市禽类市场进行相关标本采集,用实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒,阳性标本再进行H5和H7亚型禽流感病毒检测.结果 全年共采集标本3447份,A型、H5和H7亚型禽流感病毒阳性率分别为12.56％、0.75％和1.54％.中心城区和周边城区禽类市场均受到H5和H7亚型禽流感病毒的污染,病毒阳性率冬春季节大于夏秋季节.宰杀环节A型禽流感病毒检出率高(15.16％),H5和H7亚型禽流感病检出率高的标本均为地面涂抹拭子(阳性率为别为1.95％和3.41％).结论 广州市禽类市场普遍存在H5和H7亚型禽流感病毒共污染的现象,尤其以冬春季节为严重.在加强禽类市场全面清洗消毒的基础上,应重点关注宰杀环节和地表面环境等高危险因素,采取基于风险的针对性防控措施.
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表达肠出血性大肠杆菌 O157:H7 EspA 抗原的减毒沙门氏菌株的构建
目的 利用平衡致死系统构建表达O157:H7 EspA 的减毒鼠伤寒沙门氏菌.方法 构建表达EspA的重组质粒,再将其转入终宿主菌减毒鼠伤寒沙门氏菌x4550 株中构建成口服活疫苗株,用IPTG进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westen-blot检测EspA蛋白的表达情况.并观察重组菌体外培养的稳定性.结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌,经Tricine-SDS-PAGE电泳出现了1条Mr约21 000的蛋白条带,Westen-blot检测能与抗EspA的单克隆抗体发生特异性反应.且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论 表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌构建成功,为发展口服抗EHEC O157:H7的疫苗奠定了初步基础.
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肠出血性大肠杆菌0157:H7 TCCP蛋白研究进展
TCCP(内膜素受体偶联细胞骨架蛋白,Tir couple cytoskeleton protein)是近年研究新发现的EHEC(肠出血性大肠杆菌)0157:H7致病分子,它经大肠杆菌Ⅲ型分泌系统转导人宿主细胞内,结合并活化宿主蛋白N-WASP(神经威奥综合症蛋白),引起肌动蛋白的聚集,终诱导特征病理改变黏附、擦拭(A/E)损伤的形成.本文就近年来对它的研究情况作一简要综述.
关键词： 肠出血性大肠杆菌0157 H7 tccP 黏附与擦拭损伤
