首页 > 文献资料
-
EHEC O157∶H7紧密黏附素及突变体与受体Tir的结合特性研究
目的 表达纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC) O15∶H7的紧密黏附素(intimin)及突变体intiminN916Y,并构建其转位紧密黏附素受体(translocated intimin receptor,Tir)结合片段(intimin binding domain,Tir-IBD),通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tir-IBD蛋白质相互作用特性的变化,探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响.方法 设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Tir-IBD的编码基因tir-ibd,TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a(+)-tir-ibd,经测序鉴定后转化E.coli BL21( DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测.目的蛋白经Ni-NTA亲和纯化后,再用阴离子交换柱Resource Q和分子筛柱Superdex 200进行纯化.同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminN916Y,将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片,在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体intiminN916Y作为流动相进行BIACore检测.结果 EHEC O15∶H7基因组扩增出了约270 bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a(+)-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致.转化E.coli BL21( DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约10×103,破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达.Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显,高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片,在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tir-IBD相互作用的BIACore检测结果显示,intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性.结论 EHEC O157∶H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达,纯化后获得高纯度的目的蛋白.在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系,证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性.
-
肠出血性大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素免疫保护性片段的基因克隆与表达
目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7紧密黏附素(intimin)免疫保护性片段(intiminC300). 方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC300,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-28a(+)-eae及pET-28a(+)-eaeC300,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测. 结果 PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增出了约2800 bp和900 bp的目的片段;原核表达质粒pET-28a(+)-eae及pET-28a(+)-eaeC300经酶切及测序鉴定与预期序列一致.转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约25%和30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约96×103和35×103,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达. 结论 EHEC O157∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础.
-
肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗免疫小鼠的实验研究
目的 研究肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力.方法 将60只BALB/c小鼠平均分为5组,分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PBS对照组,用注射方式免疫3次,抗原和佐剂均为每次100μg/只.采集免疫前和各次免疫后7d的小鼠血清检测抗体,末次免疫10d后以109CFU的0157全菌液经口感染小鼠.观察小鼠临床症状及死亡情况,检测粪便与肠道带菌情况,并作病理组织学检测.结果 各抗原免疫组小鼠特异抗体明显增加,感染后各组小鼠均有死亡,IntiminC300、Stx2B、HlyAN436和联合免疫组保护率分别为73%、64%、36%和91%.未病死小鼠粪便排菌情况:对照组22d,实验组为5～14d.肠道带菌情况:对照组阳性率为100%,实验组为25%～83%.病死小鼠肺脏、肝脏均有明显组织病理学改变.结论 Intim-inC300、Stx2B和HlyAN436疫苗对于O157感染具有一定的预防作用,而联合免疫效果又大于单独免疫.
-
肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析
目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b(+)-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.
-
福建省非典型肠致病性大肠杆菌紧密黏附素基因分型分析
目的 了解福建省非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)分离株紧密黏附素基因(eaeA)型别的分布情况.方法 根据eaeA基因3 '端的不同,采用18对引物用PCR基因扩增方法,对30株aEPEC分离株的进行紧密黏附素(intimin)基因的扩增.结果 分离的30株检出了6个紧密黏附素基因型别(eae-α1、β1、δ/κ/β20、η、ε1、θ/γ2),阳检率分别为eae-α13.3％(1)、eae-β1 20％ (6)、eae δ/κ/β20 36.7％(11)、eae-η1 3.3％(4)、eae-￡1 3.3％(1)、eae-θ/γ2 10％(3)、未分型16.7％(5).结论 福建省aEPEC分离株的紧密黏附素基因型别表现为多态性;eae-δ/κ/β20和eae-β1型另是福建省aEPEC菌株紧密黏附素基因的主要的型别;intimin基因分型在aEPEC暴发事件流行病学调查上具有一定的意义.
关键词： 非典型肠致病性大肠杆菌 紧密黏附素 基因分型 -
肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究
目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.
-
肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素与受体的研究进展
肠出血性大肠杆菌O157∶ H7能引起出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血小板减少性紫癜等.大肠杆菌O157∶ H7的主要毒力因子紧密黏附素由其毒力岛LEE岛上的eae基因编码,C末端的280个氨基酸是受体结合位点.目前发现紧密黏附素受体有紧密黏附素转位受体(Tir)、核仁素和β1整合素.紧密黏附素主要与受体Tir结合,通过Ⅲ型分泌系统转位到宿主细胞,在Tir-细胞骨架偶联蛋白(Tccp)的参与下,与N-Wiskott aldrich综合征蛋白、肌动蛋白-相关蛋白2/3相互作用产生信号级联放大,导致宿主大肠黏膜上产生黏附-抹去损伤.
