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鱼藤酮对SH-SY5Y细胞中核仁素、α-突触核蛋白和DJ-1相互作用的影响
目的 探索在鱼藤酮(Rotenone)染毒的SH-SY5Y细胞中,核仁素(Nucleolin,NCL)与两种已知与帕金森病(Parkinson Disease,PD)相关的基因α-Synuclein和PARK7(Parkinson disease protein7,又称DJ-1)编码的蛋白α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)和DJ-1的相互作用.方法 采用MTT法检测鱼藤酮(20、100和500 nmol/L)染毒SH-SY5Y细胞24 h和3d后对细胞存活率的影响;采用免疫荧光染色法(Immunofluorescent staining,IF)分别染色3种蛋白,在共聚焦显微镜下观察蛋白的亚细胞定位,分析3种蛋白在空间上的关系;采用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)和免疫蛋白印记(Western Blot,WB)法检测染毒前后核仁素分别与DJ-1和α-Synuclein的相互作用.结果 用鱼藤酮(20、100和500 nmol/L)染毒SH-SY5Y细胞24h后,各个染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);染毒3d后20 nmol/L染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05),而100和500 nmol/L染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).激光共聚焦分析显示D J-1和核仁素分布于SH-SY5Y细胞核和细胞质中,而α-Synuclein分布于细胞质中,核仁素与DJ-1和α-Synuclein都有共定位.鱼藤酮染毒SH-SY5Y细胞前后,核仁素分别与D J-1和α-Synuclein免疫共沉淀后,免疫蛋白印迹结果显示核仁素与二者均可形成蛋白复合体.结论 在SH-SY5Y细胞中核仁素与DJ-1和α-Synuclein都存在蛋白-蛋白相互作用,染毒鱼藤酮后核仁素与DJ-1和α-Synuclein的相互作用并没有消失,提示核仁素可能是帕金森病相关蛋白.
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核仁素在甲状腺乳头状癌中表达的临床意义
目的 探讨核仁素(NCL)在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义.方法 采用免疫组织化学SP染色法检测60例正常甲状腺组织与甲状腺乳头状癌中NCL、趋化因子受体-7(CCR7)与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,分析NCL、CCR7与MMP-9的表达与性别、年龄、肿瘤大小与有无转移的关系以及核仁素与CCR7、MMP-9表达的相关性.结果 NCL在正常甲状腺及甲状腺乳头状癌中的总阳性率分别为0、100％.NCL在伴随转移组癌组织中表达于细胞核、细胞质与细胞膜;NCL在无转移组癌组织中仅表达于细胞核,差异有统计学意义(P＜0.05).不同年龄、性别、肿瘤大小的NCL表达率间的差异无统计学意义(P＞0.05).核仁素细胞核外阳性表达与CCR7与MMP-9的阳性表达呈正相关(P＜0.01).结论 NCL在甲状腺乳头状癌中表达,表达部位在转移与非转移组明显不同,且与CCR7、MMP-9表达有密切关系.核仁素可作为区别癌转移与非转移的标志.
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核仁素表达下调对宫颈鳞状细胞癌细胞生长的影响
目的 探讨核仁素(C23)表达下调对宫颈鳞状细胞癌细胞生长的影响.方法 采用免疫组化方法标记C23在宫颈鳞状细胞癌中的表达情况,通过RNA干扰技术将C23 siRNA质粒转染到宫颈鳞状细胞癌的癌细胞中,下调其表达;细胞增殖采用MTS检测,细胞侵袭能力采用transwell检测.结果 C23在宫颈鳞状细胞癌细胞的核仁、胞浆及胞膜上均表达.MTS法检测显示,癌细胞生长速度减慢,与对照组和空白组对比,差异有统计学意义(P<0.01).流式细胞仪检测显示,干扰后癌细胞凋亡增加,尤以早期凋亡为明显;transwell检测显示,siRNA干扰组的癌细胞穿膜细胞数为(277.00±59.30)个,显著少于对照组的(417.17±43.60)个和空白组的(443.17±37.19)个,差异有统计学意义(P<0.01).结论 宫颈鳞状细胞癌的癌细胞C23下调可抑制癌细胞生长,促进细胞凋亡,减弱癌细胞的侵袭能力.
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气管内滴入核仁素shRNA表达载体对脂多糖肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞活化的影响
目的 建立气管内滴入核仁素shRNA表达载体的实验模型,观察其对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)大鼠肺泡巨噬细胞(AM)活化的影响,探讨AM膜核仁素在LPS致大鼠ALI中的作用及机制.方法 选择健康雄性SD大鼠40只,随机分为A组(空白对照组),B组(ALI组),C组(转染重组质粒pBS-U6.C23shRNA并ALI组),D组(转染对照质粒pBS-U6.ControlshRNA并ALI组).大鼠经尾静脉注射LPS以建立ALI模型,气管内滴入法转染重组质粒pBS-U6.C23shRNA表达载体,免疫印迹(Western blot)检测AM膜核仁素蛋白表达;核酸电泳迁移率实验(EMSA)检测AM中核因子(NF-κB)活性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)表达.结果 转染pBS-U6.C23shRNA表达载体后可以显著下调AM膜核仁素蛋白表达;减轻肺病理损伤;降低NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量.与A组相比,B组及D组的大鼠AM膜核仁素蛋白表达显著增加,组间有统计学差异(P＜0.01);C组大鼠AM膜核仁素蛋白表达明显下调,与B组相比,组间差异有统计学意义(P＜0.01);而D组与B组中的大鼠AM膜核仁素蛋白表达组间没有统计学差异(P＞0.05).经LPS处理后,各组大鼠AM中NF-κB活性显著增加,与A组相比,组间差异非常明显(P＜0.01).C组大鼠AM中NF-κB活性明显降低,与B组比较,差异显著(P＜0.05);而D组与B组比较,组间无明显差异(P＞0.05).经LPS诱导肺损伤后,显著增加了大鼠BALF中促炎因子TNF-α和IL-6的表达,各组和A组相比差异显著(P＜0.01);C组大鼠BALF中TNF-α和IL-6的含量显著降低,与B组相比差异显著(P＜0.01);而D组与B组相比,组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 气管内滴入法可以安全有效转染核仁素shRNA表达载体,抑制AM活化,减轻肺损伤,AM膜核仁素参与了LPS致大鼠ALI的发病过程.
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电离辐射作用后p53对核仁素的调控作用研究
核仁素(Nucleolin),是细胞核仁中的一种磷酸化蛋白,主要定位于真核细胞核仁的颗粒区和致密纤维组分[1-3].研究发现Nucleolin除了在核仁中发挥作用外,还具有在核仁、细胞核、细胞质之间穿梭的特性[4].
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核酸适配体AS1411的磷硫骨架烷基化修饰及其生物学性质研究
对寡核苷酸进行恰当的化学修饰可以提高其稳定性并增加其生物学活性.该研究探索了一种以PBS缓冲液(pH 7.4)及甲醇作为溶剂在温和条件下进行核酸磷硫骨架烷基化修饰从而引入烷基功能基团的高效绿色化学合成方法,可以同时适用于硫代单核苷酸及寡核苷酸磷酸骨架硫代位点的烷基化修饰,其综合产率为81％-91％.利用该方法设计合成烷基化修饰的核酸适配体AS1411s,生物学评价发现1位磷硫(PS)烷基化修饰的AS1411可提高其与靶蛋白作用能力和血清稳定性,并表现出较强的K562和HL-60肿瘤细胞生长抑制作用.磷硫骨架烷基化修饰的核酸适配体AS1411s可以作为潜在的肿瘤检测剂与治疗药物进行更深入的研究.
关键词： 硫代核苷酸 烷基化修饰 核酸适配体AS1411 核仁素 -
内皮抑素抗肿瘤机制和应用的研究进展
内皮抑素自发现以来一直被认为是肿瘤生长过程中重要的抗血管形成因子,也成为肿瘤抗血管治疗的重要靶点.内皮抑素抗肿瘤作用机制和临床应用的研究一直是肿瘤靶向治疗领域研究的热点,但其具体的作用机制及其如何提高临床疗效仍然存在诸多争议.现就近年来国内外对于内皮抑素抗肿瘤作用机制及临床应用的研究进展予以综述.
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核仁素在脓毒症小鼠心肌损伤中的表达及其作用
目的 探讨核仁素在脓毒症小鼠心肌损伤中的表达及其作用.方法 采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症小鼠模型.实验动物随机分为4组:野生鼠C57BL/6+假手术组(WT+Sham)、WT鼠+脓毒症组(WT+CLP)、心肌特异性过表达转基因鼠(TG鼠)+假手术组(TG+Sham)及TG鼠+脓毒症组(TG+CLP).Western blotting观察脓毒症术后0、12、24、48 h核仁素的表达情况;术后24 h检测血流动力学指标、血清心肌损伤指标肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白(cTnI)水平、心肌细胞中活性氧(ROS)及心肌组织中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平的变化情况.两组间数据比较采用t检验.结果 与WT+Sham组相比,WT+CLP组心肌组织中核仁素表达明显升高(2.57±0.34比1.00±0.15,t=7.468,P＜0.01);与WT+Sham组相比,WT+CLP组7d生存率显著下降(33.3％比100％,x2=13.375,P＜0.01);左心室等容收缩压力上升的大速率(+dp/dtmax)显著下降(t=4.993,P＜0.01,n=10),血清CK-MB、cTnⅠ水平明显升高(t=5.031、4.335,均P＜0.01),心肌组织中ROS和MDA水平亦显著升高(t=3.365、2.375,均P＜0.05).与WT+CLP组相比,TG+ CLP组小鼠7d存活率明显升高(60.0％比33.3％,x2=8.227,P=0.004),+dp/dtmax明显改善(t=2.337,P=0.019),血清CK-MB、cTnⅠ水平及心肌组织中ROS、MDA水平均明显下降(t=2.127、3.347、2.115、2.224,均P＜0.05).结论 小鼠脓毒症可诱导心肌组织中核仁素表达上调,心肌特异性过表达核仁素可减轻脓毒症小鼠中氧化应激所致的心肌损伤和心功能障碍,降低其死亡率.
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核仁素和骨形态发生蛋白-2在胃癌细胞上皮间质转化中的作用
目的 上皮间质转化(EMT)在胃癌的发展中发挥重要作用.核仁素(C23)和骨形态发生蛋白-2(BMP2)均与EMT过程相关.但是,BMP2介导EMT的具体机制还不清楚.本研究拟对C23/BMP2在胃癌细胞EMT中的生物学作用进行研究.方法 利用免疫印迹法研究C23和BMP2受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)在多种胃癌细胞系中的表达模式.采用si-C23 RNA处理胃癌细胞系,检测C23表达被阻断后该胃癌细胞中与EMT相关指标的变化.结果 C23和BMPR-Ⅱ在胃癌细胞系中出现异常表达和诱导性表达.MGC803细胞中的p-ERK1/2、p-Akt、波形蛋白、N-钙黏蛋白的表达被BMP2所诱导,且呈现剂量依赖关系.相比之下,si-C23 RNA转染MGC803细胞后,将会减低BMP2诱导的p-Erk1/2、p-Akt、波形蛋白、N-钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达.另外,si-C23 RNA转染可以降低MGC803细胞的迁移和侵袭能力.结论 在胃癌细胞系中,C23可以经由上调Erk1/2和Akt信号介导BMP2诱导的EMT进程,这表明核仁素(C23)和BMPR-Ⅱ通路可以作为胃癌治疗的潜在靶点或生物标记而发挥重要作用.
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靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选
目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能优序列,为进一步相关研究奠定基础.
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稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定
目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.
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外周血T淋巴细胞Ag-NORs的检测对肿瘤患者的诊断价值
细胞核仁形成区嗜银蛋白的Ag-NORs是一种酸性非组蛋白,由B23、核仁素、纤维素和RNA多聚酶组成[1].可与特定的DNA部位结合,解除组蛋白对rDNA转录的抑制作用,从而促进rDNA的转录生成rRNA,可被银染的非组蛋白与rDNA的转录活性密切相关.Ag-NORs是近年来受到广泛重视并应用于肿瘤学研究的一项新指标[2].通过检测外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量可了解T淋巴细胞增殖活性,是反映机体细胞免疫功能状况的可靠手段,对肿瘤患者的鉴别诊断,疗效观察及预后评估进行了探讨.
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结肠腺癌核仁素表达和Ki67标记的增殖指数的关系
目的 检测结肠腺癌中核仁素(C23)表达和Ki67标记的增殖指数的关系,分析其临床意义.方法 65例结肠腺癌患者的临床资料及术后蜡块组织作为观察组,正常结肠黏膜组织25例作为对照组,采用免疫组化方法检测两组中C23和Ki67的表达.结果 观察组中C23和Ki67的阳性率明显高于对照组(均P<0.001).观察组中C23和Ki67表达与肿瘤大径和浸润深度密切相关,C23表达与肿瘤分化程度密切相关.相关分析显示观察组中C23和Ki67呈正相关.结论 结肠腺癌中C23和Ki67高表达可以促进肿瘤形成和进展,C23和Ki67有一定的协同作用.
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核仁素在小鼠帽状期牙胚中的特异性表达
目的 检测核仁素在小鼠胚胎帽状期牙胚发育过程中的特异性表达,并推测其可能的生物学作用.方法 采用原位杂交和免疫组化方法分别检测核仁素mRNA和蛋白在小鼠胚胎第15天(E15)发育牙胚中的表达.核仁素和TUNEL的双重荧光染色观察核仁素与牙胚中凋亡细胞的关系.结果 核仁素mRNA和蛋白主要表达于E15牙胚中的颈环、内釉上皮及其下邻接的牙乳头部分;核仁素蛋白还存在于原发性釉结节和基底膜之中.双重荧光染色显示,核仁素的分布与原发性釉结节中凋亡细胞的位置不重合.结论 在帽状期牙胚中,核仁素mRNA与蛋白的表达并不完全一致.核仁素蛋白在基底膜中的表达提示其可能通过参与内釉上皮与牙乳头间充质的相互作用而影响牙胚的形态发生.
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血清核仁素检测在结肠癌中的临床应用
目的:探讨核仁素(nucleolin)在结肠癌患者血清中的水平与临床意义.方法:用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测172例结肠癌患者、24例直肠癌患者和80例健康体检者血清中核仁素含量,并分析血清核仁素水平与结肠癌患者临床病理特征之间的关系.结果:结肠癌患者血清中核仁素含量为(228.9±212.4)pg/mL,直肠癌患者为(115.1±34.5)pg/mL,健康对照组为(101.13±32.4)pg/mL.结肠癌患者血清核仁素水平明显高于健康对照组(P＜ 0.001),直肠癌患者与健康对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).在结肠癌检测中,血清核仁素敏感性为91.9％、特异性为83.8％,癌胚抗原(carcino-embryonicantigen,CEA)敏感性为68.6％、特异性为85.0％.浸润型结肠癌患者中血清核仁素水平明显高于隆起型和溃疡型(P＜0.05).结肠癌患者血清核仁素水平与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、浸润程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、Ducks分期均无相关性(P均＞0.05).结论:结肠癌患者血清核仁素检测敏感性和特异性较高,敏感性优于CEA,特异性与CEA相当,对结肠癌的诊断有潜在应用价值.
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藻蓝蛋白对肿瘤细胞增殖及核仁素表达的影响
目的 探讨藻蓝蛋白对肿瘤细胞增殖及核仁素表达的影响.方法 体外培养人结肠癌细胞SW480、人喉癌细胞HEP-2、人卵巢癌细胞SKOV-3和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,采用MTT法检测藻蓝蛋白对细胞增殖的影响.光学显微镜下观察细胞形态的变化,RT-PCR和Westernblot分别检测核仁素的mRNA和蛋白表达.结果 藻蓝蛋白对BEAS-2B细胞的增殖没有抑制作用,但呈时间和剂量依赖性地抑制SW480、HEP-2和SKOV-3细胞的增殖.与藻蓝蛋白0μg/ml比较,藻蓝蛋白80 μg/ml作用后的SW480、HEP-2和SKOV-3细胞中核仁素mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.05),而BEAS-2B细胞中核仁素的变化无统计学差异(P＞0.05).结论 藻蓝蛋白可抑制肿瘤细胞增殖,并降低核仁素的表达,提示核仁素可能是藻蓝蛋白抗肿瘤作用的靶点.
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核仁素的表达定位和定量与前列腺癌演变的关系
目的 探讨前列腺癌和非癌组织中核仁素表达定量和定位的差异,及核仁素表达的增高和核外迁移对鉴别诊断前列腺癌和非癌组织的价值.方法 用免疫组化SP法检测50例前列腺癌组织和50例非癌组织中核仁素的表达,分析前列腺癌组织和非癌组织中核仁素表达定量和定位的差异,并比较核仁素与p504S和p63在前列腺癌中表达的相关性,分析前列腺癌中核仁素表达定量与癌组织Gleason评分的关系.结果 前列腺癌和非癌组织中细胞核均表达核仁素;前列腺癌胞质和胞膜核仁素的阳性表达率(90%)明显高于癌旁正常前列腺组织(5%)、前列腺增生症(13%)和前列腺上皮内瘤变(20%)(P＜0.01).Allred半定量分析显示,前列腺癌组织中核仁素表达量(7.7±0.3)高于癌旁正常前列腺组织(3.9±0.2)、前列腺增生症(4.0±0.4)和前列腺上皮内瘤变(5.5±0.2)(P＜0.01).在前列腺癌中,核仁素胞质阳性表达与癌细胞p504S的阳性表达呈正相关,与基底细胞p63的阳性表达呈负相关(P＜0.01).前列腺癌中核仁素表达定量与Gleason评分呈正相关(P＜0.01).结论 前列腺在癌变过程中核仁素表达增高,并出现核外迁移;核仁素的核外迁移是前列腺癌变的重要标志,前列腺癌中核仁素表达量的增高提示患者预后差.
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核仁素在结节性甲状腺肿与甲状腺乳头状癌中表达及意义的研究
目的:研究核仁素在结节性甲状腺肿及甲状腺乳头状癌中的表达,探讨核仁素在二者疾病发生中的作用及临床意义.方法:采用免疫组化SP法检测36例结节性甲状腺肿及60例甲状腺乳头状癌中核仁素的表达,分析核仁素的表达与性别、年龄、有无转移及病理过程的关系.结果:核仁素在正常甲状腺、结节性甲状腺肿及甲状腺乳头状癌中的总阳性率分别为0、44,4％、100％,差异有统计学意义(P＜0.01).结节性甲状腺肿中核仁素表达于结节期的滤泡上皮细胞核,而胶质贮存期滤泡上皮与结节期的纤维组织不表达.核仁素在伴有转移的乳头状癌组织中表达于细胞核、细胞质与细胞膜,而核仁素在无转移的癌组织中仅表达于细胞核,差异均有统计学意义(P＜0.01).核仁素表达与患者年龄、性别无关(P＞0.05).结论:核仁素参与了结节性甲状腺肿及甲状腺乳头状癌的病理过程,表达随疾病恶化而向核外转移.核仁素可作为判断甲状腺乳头状癌有无转移的客观指标,对指导临床治疗有重要意义.
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核仁素表达下调对宫颈癌细胞Hela生物学行为的影响
目的 探讨核仁素表达下调对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响.方法 实验分4组:3个靶向人核仁素基因的实验组(siN1组、siN2组、siN3组)及1个阴性对照组(NC组).体外化学合成各组siRNA并转染HeLa细胞；利用荧光实时定量RT-PCR法和Western blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测核仁素基因的干扰效率,并筛选出干扰效率高的片段；利用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测核仁素下调对HeLa细胞增殖活性的影响；利用流式细胞学Annexin V-FITC检测转染后HeLa细胞凋亡率的改变；Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变.结果 与NC组相比,各实验组核仁素mRNA表达水平均下降(P＜0.05)；蛋白表达水平也相应下调(P＜0.05).成功筛选出佳干扰片段siN2,用于后续实验.siN2组HeLa细胞生长速率明显受到抑制(P＜0.05)；流式细胞学Annexin V-FITC检测siN2组HeLa细胞凋亡率明显高于NC组(P ＜0.05)；Transwell实验显示siN2组HeLa细胞侵袭能力减弱(P＜0.05).结论 核仁素表达下调明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭能力,促进细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了理论依据.
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核仁素转录激活子功能研究
目的:研究核仁素的转录激活子作用,探讨CD+34分子的基因转录调节机制.方法:分别构建核仁素的表达质粒,以及野生型和含有缺失突变的CD+34基因调控区质粒,启动子区下游含有荧光素酶报告基因.这些报告质粒的调控区分别是:①0.8kb野生型CD+34基因上游5'端序列;②缺失了127个核苷酸的CD+34基因上游5'端序列.应用瞬时转染试验,研究人CD+34基因上游5'端的转录特征,分析核仁素对CD+34基因的转录调节功能.结果:①含野生型CD+34基因上游5'端序列的报告质粒的相对荧光素酶活性约为空质粒pGL3-Basic的3倍;CD+34基因上游调控区的活性可被核仁素激活,其相对荧光素酶活性是空质粒的8倍.②CD+34基因上游5'端有127nt.缺失的报告质粒的相对荧光素酶活性与空质粒pGL3-Basic的活性相同,且与核仁素表达质粒共转染细胞时,其相对荧光素酶活性没有变化.结论:核仁素对CD+34基因起转录激活作用.CD+34基因上游5'端自-470nt.至-344nt.的区域对CD+34基因的表达具有重要意义.
