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098 鱼藤酮的神经毒性研究进展
鱼藤酮是一种低毒的天然杀虫剂,但是近年来发现它对机体的多巴胺能神经系统功能有损伤作用,体外和体内研究的结果都表明鱼藤酮可诱导多巴胺能神经细胞的退变和死亡,鱼藤酮暴露可以使动物出现帕金森病样症状,但因实验室的条件与人类接触的方式有所不同,目前的研究尚不足以肯定鱼藤酮可导致人类的帕金森病.本文综述了近年来的有关研究进展.
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鱼藤酮对大鼠主要器官毒性作用特点研究
鱼藤酮作为广泛应用的杀虫剂可以导致多巴胺能神经元退变[1-2].鱼藤酮透过血脑屏障以及细胞膜,不依赖多巴胺转运体(dompamine transporter,DAT)就可以直接进入胞质选择性作用于线粒体而造成细胞死亡[3].
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鱼藤酮对SH-SY5Y细胞中核仁素、α-突触核蛋白和DJ-1相互作用的影响
目的 探索在鱼藤酮(Rotenone)染毒的SH-SY5Y细胞中,核仁素(Nucleolin,NCL)与两种已知与帕金森病(Parkinson Disease,PD)相关的基因α-Synuclein和PARK7(Parkinson disease protein7,又称DJ-1)编码的蛋白α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)和DJ-1的相互作用.方法 采用MTT法检测鱼藤酮(20、100和500 nmol/L)染毒SH-SY5Y细胞24 h和3d后对细胞存活率的影响;采用免疫荧光染色法(Immunofluorescent staining,IF)分别染色3种蛋白,在共聚焦显微镜下观察蛋白的亚细胞定位,分析3种蛋白在空间上的关系;采用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)和免疫蛋白印记(Western Blot,WB)法检测染毒前后核仁素分别与DJ-1和α-Synuclein的相互作用.结果 用鱼藤酮(20、100和500 nmol/L)染毒SH-SY5Y细胞24h后,各个染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);染毒3d后20 nmol/L染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05),而100和500 nmol/L染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).激光共聚焦分析显示D J-1和核仁素分布于SH-SY5Y细胞核和细胞质中,而α-Synuclein分布于细胞质中,核仁素与DJ-1和α-Synuclein都有共定位.鱼藤酮染毒SH-SY5Y细胞前后,核仁素分别与D J-1和α-Synuclein免疫共沉淀后,免疫蛋白印迹结果显示核仁素与二者均可形成蛋白复合体.结论 在SH-SY5Y细胞中核仁素与DJ-1和α-Synuclein都存在蛋白-蛋白相互作用,染毒鱼藤酮后核仁素与DJ-1和α-Synuclein的相互作用并没有消失,提示核仁素可能是帕金森病相关蛋白.
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鱼藤酮对大鼠原代培养中脑细胞血红素加氧酶-1表达的影响
目的 探讨鱼藤酮对大鼠原代培养中脑细胞血红素加氧酶-1的影响.方法 不同浓度的鱼藤酮处理原代中脑细胞培养不同时间,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测血红素加氧酶-1表达的改变.结果 鱼藤酮可致神经元发生退变;血红素加氧酶-1表达水平,在鱼藤酮处理24 h,0.01、0.1 μmol/L浓度时增加显著,1.0 μmol/L浓度组与对照组相比,差异无统计学意义;而1.0 μmol/L鱼藤酮处理6 h,血红素加氧酶-1表达显著升高,12和24 h时无变化.而RT-PCR检测鱼藤酮处理24 h后的血红素加氧酶-1表达水平无显著改变.结论 鱼藤酮引起血红素加氧酶-1表达升高,可能与细胞受损程度有关.
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鱼藤酮对中脑多巴胺能神经元毒性机制的探讨
帕金森病(PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病,临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为主要特征.本病的发病机制仍不清楚,可能是多种因素综合作用的结果.近年来,环境因素已成为PD发病机制的研究热点.
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鱼藤酮原药的基础毒性研究
鱼藤酮(rotenone)是从豆科藤本植物鱼藤的根部提取的一种天然杀虫剂,是鱼藤根中的主要有效杀虫成分,具有杀虫谱广、不污染环境和不易产生耐药性等特点,近年来被作为一种大力发展的新型的低毒农药,有着很好的应用前景.但是对它的毒性尚未见有系统性的研究报道,为此,我们研究了鱼藤酮原药的基础毒性,以期为该农药的安全生产和使用提供依据.
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脑黑质单侧注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法的建立和行为分析
目的:帕金森是目前医学难题,尚缺乏有效的治愈措施,针对其相关研究成为医学重点方向.目的:注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法探讨,并从行为学神经元形态学角度分析模型.本文实验方法和数据参考新乡医学院谷争、候田田、周度爽、赵二奇、赵营在脑黑质单侧注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法的建立和行为分析一文.方法:为了使得实验能够清楚的展现效果,采取实验组、溶媒组和正常组来进行.每组各10只清洁级NIH小鼠.实验组采用立体定向微量注射法将溶解于二甲基亚砜(DMSO)的鱼藤酮注射入小鼠脑右侧黑质致密区,溶媒组以同样的方法仅注射相同体积的DMSO,正常组不做任何处理.结果:建模后,正常组、溶媒组和实验组小鼠死亡率比较无统计学意义(P>0.05).实验组小鼠体重、爬杆实验评分评分均较对照组和溶媒组建模后明显下降(P<0.05).建模后,实验组小鼠脑黑质TH水平注射侧脑黑质区多巴胺能神经元较对侧明显减少(P<0.05).结论:鱼藤酮能选择性损毁黑质多巴胺能神经元,可较快建立稳定的成功率较高的帕金森模型.
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鱼藤酮下调对BV-2小胶质细胞中Drosha蛋白水平和白介素-1β表达影响的研究
目的 在鱼藤酮处理BV-2小胶质细胞后,观测细胞中Drosha蛋白水平的变化以及相关炎症因子的表达改变.方法 在不同浓度及时间的鱼藤酮处理后,用蛋白免疫印迹检测细胞中Drosha的蛋白水平,同时通过荧光定量PCR的方法检测Drosha下游miR 181a及其靶向炎症因子白介素-1β的表达.随后,在使用miRNAmimics补偿miR 181a的水平降低后,进一步观测白介素-1β的表达改变.结果 在鱼藤酮处理BV-2小胶质细胞后,Drosha蛋白水平呈现为浓度和时间依赖地降低,同时,其下游miR 181a的表达水平也被下调,而miR-181a的靶向炎症因子白介素-1β的表达增强.在使用miRNA mimics增加miR-181a的水平后,可抑制白介素1β的表达增强.结论 鱼藤酮在BV-2小胶质细胞通过影响Drosha蛋白及其下游miR-181a的水平,调节白介素1β的表达.
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番茄红素对鱼藤酮所致PC12细胞线粒体损伤的影响
目的:研究番茄红素对鱼藤酮诱导PC12细胞线粒体损伤的保护作用.方法:采用鱼藤酮(0.5 μmo1·L-1)诱导PC12细胞损伤模型,给予番茄红素(3,10,30 μmol·L-1)预处理2h后,加入鱼藤酮,使终浓度达到0.5μmol·L-1,培养24 h后,CCK-8法检测细胞存活率,倒置相差显微镜观察细胞形态改变、透射电镜观察细胞线粒体超微结构,罗丹明123染色检测线粒体膜电位,以观察番茄红素的保护作用.结果:CCK-8结果显示与正常对照组比较,模型组细胞存活率下降为70.34％±2.81％ (P ＜0.05),与模型组比较,番茄红素(3,10,30μmol·L-1)预处理后其细胞存活率分别提高到83.09％±3.15％,87.24％±2.15％,89.17％±2.26％(P＜0.05);倒置相差显微镜观察显示鱼藤酮可导致PC12细胞凋亡,经番茄红素处理后,模型细胞凋亡情况明显改善；透射电镜观察显示鱼藤酮可导致PC12细胞线粒体超微结构发生改变,经番茄红素处理后,模型细胞凋亡情况明显改善；流式细胞仪检测结果显示与正常对照组比较,模型组细胞线粒体膜电位平均荧光强度下降为151.63±12.25(P＜0.05),经番茄红素(3,10,30 μmol·L-1)预处理后线粒体膜电位平均荧光强度分别提高到202.24±26.28,226.21±9.71,238.83±10.29 (P＜0.05).结论:番茄红素对鱼藤酮诱导的PC12细胞线粒体损伤有保护作用.
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灰毛豆中异黄酮类、鱼藤酮类及coumestan类化合物分析
目的:探讨灰毛豆Tephrosia purpurea枝叶部位的化学成分;丰富灰毛豆属植物的化学成分数据库.方法:采用多种色谱分离手段和现代波谱分析方法以及通过对照文献,深入系统地对灰毛豆T.purpurea的枝叶部分进行了化学成分分离提取及结构鉴定.结果:从灰毛豆T.purpurea中共分离鉴定出10个异黄酮类化合物,分别为12a-dehydro-6-hydroxysumatrol (1),elongatin (2),tephcalostan C (3),7,4’-dihydroxy-3’,5'-dimethoxyisoflavone(4),4’-demethyhoxicarol isoflavone (5),tephcalostan B(6),5,7-di-O-prenylbiochanin A(7),tephcalostan D(8),tephcalostan (9),6a,12a-dehydro-2,3,6-trimethoxy-8-(3’,3’-dimethylallyl)-9,11-dihydroxyrotenone(10),3,4,8,9-dimethylenedioxypterocarpan (11),12a-hydroxy-β-toxicarol (12).结论:除化合物4外,其他11个化合物均为首次从该植物中分离得到.
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不同剂量鱼藤酮损伤大鼠与脾气虚证大鼠海马组织cAMP/PKA信号通路变化比较
目的:比较不同剂量鱼藤酮损伤大鼠与脾气虚证大鼠海马组织cAMP/PKA信号通路的变化.方法:30只SPF级雄性大鼠,随机分为正常组,脾气虚组,鱼藤酮高、中、低剂量组(2.0、1,5、1.0mL/kg),每组6只.HE法观察各组大鼠海马形态变化,ELISA法检测各组大鼠海马组织cAMP含量,Real-time PCR法和Western Blot法检测蛋白激酶(PKA)、糖原磷酸化酶(Gp)、磷酸化酶激酶(PHK)的mRNA及其表达量.结果:与正常组大鼠比较,鱼藤酮各剂量组大鼠与脾气虚证组大鼠的海马组织形态变化不明显,其cAMP含量及PKA、Gp、PHK mRNA和蛋白的表达均有不同程度的减弱,3组中鱼藤酮中剂量组的结果与脾气虚证组具有一定相似性.结论:中剂量鱼藤酮损伤大鼠海马cAMP/PKA信号通路的变化与脾气虚证大鼠之间存在关联性,脾气虚证大鼠海马cAMP/PKA信号通路的改变可能与调控代谢相关基因Gp、PKA、PHK的表达有关.
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电针对鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠脑黑质氧化应激作用的影响
目的:观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型氧化应激作用的影响.方法:所有实验动物随机分空白组、模型组、电针预处理组、电针治疗1周组、电针治疗2周组、电针治疗3周组、电针治疗4周组,每组10只,采用背部皮下注射鱼藤酮法制备模型.紫外分光光度法测定中脑黑质部位超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量的变化；同时采用免疫组化法观察黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性表达神经元.结果:与模型组相比,电针预处理组和电针治疗组均能提高GSH和SOD、CAT活力,降低MDA含量.大鼠黑质部TH阳性细胞明显增多.结论:电针能明显提高大鼠黑质区抗氧化应激能力.
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滋肾益髓方对帕金森病小鼠分子伴侣介导的自噬途径的影响
目的:通过观察帕金森病(PD)小鼠脑内组织蛋白酶D(Cath D)、热休克蛋白70(HSP70)的表达探讨中药滋肾益髓方对分子伴侣介导的自噬途径(CMA)的影响及其治疗PD可能机制.方法:将C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、西药组和中药组.鱼藤酮灌胃法建立PD小鼠模型,给药组在造模后采取不同治疗措施.自主活动测试法观察小鼠行为学;免疫组织化学技术检测小鼠中脑黑质Cath D、HSP70表达.结果:经治疗后中药组及西药组小鼠自主活动次数均较模型组明显增高(P＜0.05).模型组小鼠黑质区CathD、HSP70表达较空白组明显减少(P＜0.05),中药组及西药组小鼠黑质区Cath D、HSP70表达较模型组明显增高(P＜0.05).结论:中药滋肾益髓方可能通过增强CMA途径达到治疗PD的目的.
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电针对帕金森病模型大鼠中脑黑质p38丝裂原活化蛋白激酶的影响
目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导的炎性反应在电针防治帕金森病(Parkinson disease,PD)模型大鼠中的作用.方法:健康雄性SD大鼠32只,随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组,每组8只.模型组与电针组大鼠采用颈背部皮下注射鱼藤酮(2 mg/kg,溶解于葵花油,浓度2 mg/mL)制备PD模型；假手术组,在与模型组大鼠相同部位注射等量的不含鱼藤酮的葵花油乳化液；正常组不作处理.电针组取“风府”“太冲”行电针治疗(连续波,频率2 Hz,强度1 mA,通电20 min),1次/d,连续14d.其他组不予干预治疗.采用免疫组化法检测各组大鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)、环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达变化.结果:模型组大鼠出现典型的PD行为学改变,中脑黑质区TH阳性神经元计数较正常组、假手术组显著降低,p-p38 MAPK、COX-2阳性神经元计数较正常组、假手术组显著升高,经统计学分析,差异均具有统计学意义(均P＜0.01)；电针组TH阳性神经元计数较模型组明显升高,p-p38 MAPK、COX-2则较模型组表达下降,经统计学分析,差异均具有统计学意义(均P-＜0.01).结论:电针治疗可明显降低PD大鼠炎性介质COX-2的表达,抑制p38 MAPK磷酸化,减轻PD大鼠多巴胺能神经元的损伤,这一作用可能与其影响p38 MAPK信号通路有关.
关键词： 帕金森病 鱼藤酮 电针 p38丝裂原活化蛋白激酶 环氧合酶 -
黄芩苷对鱼藤酮致PC12细胞损伤的保护作用研究
目的:探讨黄芩苷对鱼藤酮致PC12细胞损伤的保护作用及其机制.方法:建立鱼藤酮损伤PC12细胞模型,采用终浓度分别为0.1,1,10 μmol·L-1的黄芩苷进行药物干预;四氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,并用显微镜观察细胞形态;应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;采用荧光探针二氯荧光素-双乙酸盐(DCF-DA)测定细胞内氧自由基(ROS);采用蛋白免疫印记法检测凋亡信号蛋白Bcl-2,Bax及Caspase-3表达.结果:PC12细胞经1.5 μmol·L-1鱼藤酮孵育24 h后细胞活力显著降低,黄芩苷对鱼藤酮所致的细胞损伤呈现剂量依赖性的保护作用;流式细胞术分析表明黄芩苷可明显减少鱼藤酮致PC12细胞凋亡比例;荧光显微镜观察发现黄芩苷能明显减少鱼藤酮损伤PC12细胞ROS含量,免疫印迹实验表明黄芩苷可上调模型细胞Bcl-2及下调Bax表达并减少活化Caspase-3含量.结论:黄芩苷对鱼藤酮诱导的PC12损伤具有保护作用活性,其机制可能与黄芩苷减少鱼藤酮诱导PC12细胞ROS含量,抑制线粒体凋亡通路有关.
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帕金森病模型大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白表达增加
目的 观察鱼藤酮对大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白(α-SYN)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响.方法 利用脑立体定位技术注射微量鱼藤酮,建立急性损伤帕金森病(PD)模型.采用动物行为轨迹分析软件计算各时间点30 min内运动距离和平均运动速度.免疫组织化学检测黑质(SN)部位TH、磷酸化α-SYN的表达,并统计TH和磷酸化α-SYN阳性神经元数目.结果 PD组动物各时间点30 min内运动距离、平均运动速度低于对照组(P＜0.05,0.01).同对照组相比,损伤侧SN部位TH阳性神经元数目明显减少(P＜0.01),磷酸化α-SYN阳性神经元数目明显增加(P＜0.01).结论 PD大鼠中脑黑质磷酸化α-SYN表达增加及TH的表达明显下降,并出现运动障碍.
关键词： 磷酸化α-synuclein 鱼藤酮 酪氨酸羟化酶 帕金森病 -
过表达DJ-1减轻鱼藤酮引起MN9D细胞线粒体损伤和细胞凋亡
目的 观察过表达DJ-1蛋白能否保护MN9D细胞抵抗鱼藤酮所致的线粒体损伤和细胞凋亡.方法 在MN9D细胞中分别过表达野生型DJ-1(WT)和L166P突变型DJ-1 (L166P),随后给予鱼藤酮处理.MTTr法观察细胞活力、JC-1染色观察线粒体膜电位(△Ψm)以及流式细胞仪AnnexinV+PI染色和TUNEL染色观察凋亡.结果 单纯鱼藤酮处理组细胞活力下降48.2％±6.4％,而过表达WT时,加入鱼藤酮后细胞活力仅下降22.0％±3.7％(P＜0.05),过表达L166P组跟单纯鱼藤酮组无显著性差异；鱼藤酮引起MN9D细胞△Ψm下降,过表达WT则可以部分恢复△Ψm,L166P无此作用；过表达WT-DJ-1组凋亡率分别为5.4％和9.7％,较单纯鱼藤酮处理明显下降(P＜0.05),而转染L166P细胞凋亡率跟鱼藤酮组无差异,TUNEL实验证实了同样的结果.结论 过表达野生型DJ-1能缓解鱼藤酮对MN9D细胞的损伤,具有线粒体保护功能,减少细胞凋亡的发生,而突变型L166P则无此作用.
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过表达VMAT2的CHO细胞可抵抗rotenone和MPP+的毒性作用
目的为研究毒物鱼藤酮(rotenone)和1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对野生型及过表达囊泡单胺转运蛋白(VMAT2)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的毒性作用.方法将不同浓度的MPP+、rotenone与野生型(WT-CHO)和过表达VMAT2的CHO细胞(VMAT2-CHO)共培养,通过形态学改变和MTT比色法检测细胞活力来观察毒物的毒性作用.结果VMAT2-CHO细胞活力明显增强,第5～7天VMAT2-CHO数量约为WT-CHO的3倍.0.2～2.0 mmol/L的MPP+(P＜0.05)和0.05～1.0 μmol/L rotenone(P＜0.01)作用72 h,VMAT2-CHO的存活率高于WT-CHO,细胞中毒后的形态改变不如WT-CHO明显.结论过表达VMAT2的CHO细胞对MPP+和rotenone的毒性作用有抵抗.
关键词： 单胺囊泡转运蛋白 1-甲基-4-苯基吡啶离子 鱼藤酮 中国仓鼠卵巢细胞 -
DJ-1可通过增强自噬水平缓解鱼藤酮致MN9D细胞损伤
目的 探讨DJ-1对MN9D细胞的保护作用及具体机制.方法 在MN9D细胞中瞬时转染DJ-l质粒,利用MTT法及流式细胞术分别检测MN9D细胞活力与凋亡水平.通过激光共聚焦显微镜(confocal)观察LC3自噬点数量.利用Western blot法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值.结果 过表达DJ-1能部分恢复鱼藤酮引起的细胞活力下降(P＜0.05)且可以减少鱼藤酮引起的MN9D细胞凋亡(P＜0.05).过表达DJ-1增加了鱼藤酮处理的MN9D细胞内荧光点的数量(P＜0.001)且使LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著增高(P＜0.001),应用3-MA干预后,细胞内荧光点数量回落到基础水平,且LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显降低(P＜0.05).同时应用自噬抑制剂3-MA干预后,DJ-1的细胞保护作用消失.结论 DJ-1通过激活自噬,起保护作用能减轻鱼藤酮引起的毒性.
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重组人源galectin-1通过调节自噬水平保护神经元
目的 制备重组人源半乳糖凝集素1(rhgalectin-1),并研究其对受损神经元自噬水平的促进作用.方法 利用PCR技术构建pEGX-4T-1-galectin-1原核生物蛋白表达质粒,构建工程菌.收集rhgalectin-1蛋白,并进行纯化及纯度鉴定.用细胞毒性物质鱼藤酮(rotenone)处理神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系,检测在有无rhgalectin-1预处理的情况下自噬标志物LC3Ⅱ以及p62的水平,分析不同组别细胞的自噬水平.结果 成功制备了具有生物学活性的rhgalectin-1,发现rhgalectin-1可降低鱼藤酮对SK-N-SH细胞的毒性作用.鱼藤酮处理SK-N-SH细胞后,其自噬水平有所降低.表现为LC3Ⅱ水平明显降低以及p62水平明显增加(P<0.05).而rhgalectin-1预处理组细胞自噬水平明显增加,LC3Ⅱ水平明显升高,p62水平明显降低(P<0.05).当用自噬阻断剂bafilomycin阻断自噬体降解后,可观察到rhgalectin-1预处理并给予鱼藤酮刺激组较单独鱼藤酮刺激组LC3Ⅱ水平明显增加(P<0.05),此现象说明了rhgalectin-1处理的确增强了自噬水平而不是抑制自噬体的降解.结论 rhgalectin-1可以增强神经元的自噬水平,这一特性可能在神经元的毒性抵抗以及损伤后修复过程中发挥重要作用.
