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DJ-1可通过增强自噬水平缓解鱼藤酮致MN9D细胞损伤
目的 探讨DJ-1对MN9D细胞的保护作用及具体机制.方法 在MN9D细胞中瞬时转染DJ-l质粒,利用MTT法及流式细胞术分别检测MN9D细胞活力与凋亡水平.通过激光共聚焦显微镜(confocal)观察LC3自噬点数量.利用Western blot法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值.结果 过表达DJ-1能部分恢复鱼藤酮引起的细胞活力下降(P＜0.05)且可以减少鱼藤酮引起的MN9D细胞凋亡(P＜0.05).过表达DJ-1增加了鱼藤酮处理的MN9D细胞内荧光点的数量(P＜0.001)且使LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著增高(P＜0.001),应用3-MA干预后,细胞内荧光点数量回落到基础水平,且LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显降低(P＜0.05).同时应用自噬抑制剂3-MA干预后,DJ-1的细胞保护作用消失.结论 DJ-1通过激活自噬,起保护作用能减轻鱼藤酮引起的毒性.
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自噬在顺铂诱导食管癌TE1细胞死亡中的作用
目的 观察顺铂联合自噬特异性增强剂beclin1和特异性抑制剂3-MA对食管癌细胞增殖抑制的影响,探讨自噬在顺铂诱导的食管癌TE1细胞死亡中的作用.方法 MTT法检测空白对照组、顺铂组、顺铂分别联合beclin1和3-MA组对食管癌TE1细胞增殖抑制作用的影响;Western blot法检测顺铂对食管癌TEl各组细胞中bcelin1蛋白表达的影响;MDC荧光染色检测各组细胞内自噬囊泡数量的变化;流式细胞仪检测各组细胞中细胞周期和凋亡的改变.结果 MTT检测各组细胞的增殖抑制率分别为:1.06％,31.59％,18.93％,51.44％.DDP组能有效抑制TE1细胞的增殖.与单独使用DDP组相比,beclin1+ DDP组对TE1细胞的增殖抑制率明显降低(P＜0.01);3-MA+ DDP组对TE1细胞的增殖抑制率明显增高(P＜0.01);Western blot检测各组细胞中beclin1蛋白表达量分别为0.319±0.029,1.175±0.06,1.537±0.076,0.91±0.047(P ＜0.01);荧光显微镜观察beclin1+ DDP组中MDC标记的自噬荧光强度高,细胞质内出现了明显的绿色荧光;FCM检测细胞周期分布结果显示,各组细胞中G0/G1期细胞比例分别为(44.82±0.437)％,(56.25±0.624)％,(27.553±0.085)％,(66.48±0.638)％;各组细胞中S期细胞比例分别为(34.85±0.235)％,(24.417±0.607)％,(51.8±0.721)％,(19.167±0.666)％.各组细胞的凋亡率分别为(1.237±0.015)％,(4.813±0.025)％,(1.32±0.01)％,(6.117±0.035)％(P＜0.01).结论 顺铂可以诱导食管癌TE1细胞自噬和凋亡;反应性的自噬活性增强可能与顺铂耐药的形成有关,自噬水平的下调可能增加了食管癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性,提示监测及调控肿瘤细胞的自噬水平可能为逆转食管癌顺铂耐药提供新的思路.
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自噬调节药物对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响
目的:探讨自噬调节药物包括自噬激活剂(雷帕霉素)、自噬抑制剂(羟氯喹和3-甲基腺嘌呤)对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和自噬的影响.方法:采用不同浓度雷帕霉素(RAPA)、羟氯喹(HCQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理RPMI 8226细胞,用CCK-8法检测药物对细胞增殖的作用,流式细胞术检测药物作用24 h后细胞凋亡率,应用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬小体数量,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC-3b和凋亡相关蛋白(caspase-3、PARP和BCL-2)的表达情况.结果:RAPA和HCQ可呈时间及剂量依赖性抑制RP-MI8226细胞的增殖,并增加细胞的凋亡,而3-MA无明显抑制细胞增殖作用,也无诱导凋亡作用.MDC染色结果显示,细胞内自噬泡数量随着RAPA浓度的提高逐渐增多,而随着HCQ和3-MA浓度升高自噬泡数量却逐渐减少.Western blot结果显示,RAPA可诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和凋亡蛋白caspase-3及PARP表达上调,但抑制抗凋亡蛋白BCL-2表达;HCQ抑制LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BCL-2表达,但可上调caspase-3和PARP表达;3-MA可下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达,但对caspase-3、PARP及BCL-2表达均未显示明显影响.结论:RAPA能抑制RPMI8226细胞增殖,诱导RPMI8226细胞凋亡和自噬,HCQ则在抑制自噬和增殖的同时也可诱导凋亡,3-MA可抑制细胞自噬但对细胞增殖和凋亡影响不大.
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3-甲基腺嘌呤对大鼠新生期惊厥致神经行为损伤的干预
目的 探讨大鼠新生期反复惊厥急性期应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对惊厥所致神经行为损伤的干预作用及机制。方法 实验在苏州大学衰老与神经疾病实验室进行。日龄6d(P6,下同)的Sprague-Dawley大鼠45只随机(随机数字法)分成三组,每组15只,惊厥组在P6吸入三氟乙醚诱导惊厥发作,持续30 min,连续6d;对照组同样操作但不吸入三氟乙醚;3-MA组惊厥前腹腔注射3 -MA(总量2μL),同样方法吸入三氟乙醚诱导惊厥,方法同惊厥组。三组大鼠于P12进行游泳行为评分测试大鼠神经运动发育,P17进行旷场实验,P43～P49行Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能,于PS0取海马组织,采用免疫印迹技术(Western blot)检测抗凋亡基因Bcl-2及自噬标记蛋白Beclin1的表达。各组行为学指标和蛋白水平采用方差分析进行统计。结果 惊厥后各组大鼠游泳行为测评,各项评分惊厥组明显低于对照组及3-MA组(P＜0.01),旷场实验显示惊厥组延迟时间[(13.33±6.69)8]较对照组[(7.11±2.37)8]和3-MA组[(9.91±4.23)s]显著延长,差异具有统计学意义(F=4.39,P＜0.05);Morris水迷宫测试RS组第4、5天逃避潜伏期较对照组和3-MA组明显延长(P＜0.05)。惊厥组海马Bcl-2表达水平(0.587±0.139)较对照组(0.782±0.083)及3-MA组(0.799±0.163)显著降低,差异具有统计学意义(F=4.71,P＜0.05)。各组Beclin1的表达差异无统计学意义(F =0.27,P＞0.05)。结论 3-MA能显著改善大鼠惊厥后神经行为损伤,并可能与上调海马抗凋亡基因Bcl-2表达有关。
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微管相关蛋白1轻链3在新生期大鼠惊厥后海马的表达
目的 研究新生期大鼠反复惊厥后海马中自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达及3-MA对表达的干预作用.方法 实验在苏州大学衰老与神经疾病实验室进行.日龄6 d的sprague-Dawley大鼠72只随机(随机数字法)分成三组,每组24只,惊厥组每日吸入三氟乙醚诱导惊厥发作5次,每次间隔30 min,连续9 d;对照组同样操作但不吸入三氟乙醚;3-MA组惊厥前腹腔注射3-MA(总量2μL),同样方法吸入三氟乙醚诱导惊厥,方法同惊厥组.三组大鼠于后一次惊厥后分别按1.5 h,3 h,6 h,24 h后取海马组织,采用蛋白质免疫印迹技术(western blot)分别检测三组大鼠大脑海马中LC-3的表达.各组LC3蛋白水平采用方差分析进行比较.结果 对照组和3-MA组同一时间点LC3表达差异无统计学意义,惊厥组(1.5 h,3 h,6 h,24 h)海马组织中LC-3的表达明显高于对照组和3-MA组同一时间点LC3表达(F值分别为4.70,5.28,8.51,5.89,P<0.05).结论 惊厥后自噬途径被激活,3-MA参与了自噬途径的调控.
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抑制自噬对艾塞那肽诱导的AR42J细胞凋亡的影响
目的 探讨艾塞那肽对AR42J细胞株的损伤及其可能机制.方法 1、5、10 pmol/L艾塞那肽处理AR42J细胞株24、48、72、96、120 h,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,筛选佳浓度和时间作为后续实验条件.设置空白对照组(NC)、艾塞那肽组(Ex-4)和Ex-4+z-VAD-fmk组,检测艾塞那肽是否可直接导致AR42J细胞凋亡;设置NC组、Ex-4组、3-MA组和Ex-4+ 3-MA组,探究3-MA能否抑制艾塞那肽诱导的AR42J细胞凋亡.3-MA为自噬抑制剂,z-VAD-fmk为凋亡抑制剂.细胞活力检测采用MTT法.流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3等凋亡相关蛋白以及微管相关蛋白轻链3(LC3)自噬相关蛋白表达.结果 以10 pmol/L艾塞那肽作用72 h为后续实验条件.z-VAD-fmk预处理可明显抑制艾塞那肽的细胞毒性,两组细胞活力为(49.4±3.0)％比(81.2±3.3)％,差异有统计学意义(P＜0.05).Ex-4组细胞凋亡率(28.2±1.4)％,高于NC组的(3.6±0.8)％,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot也显示caspase-3表达明显上调,而z-VAD-fmk预处理则可明显抑制艾塞那肽引起的细胞凋亡和caspase-3表达增加.3-MA预处理可明显抑制艾塞那肽的细胞毒性,处理72 h两组细胞活力为(49.8±2.5)％比(79.1±2.3)％,差异有统计学意义(P＜0.05).Ex-4组细胞凋亡率为(29.2±3.2)％,高于Ex-4+3-MA组的(14.5±2.1)％,差异有统计学意义(P＜0.05).Westernblot结果表明艾塞那肽可上调LC3B-Ⅱ、p62和caspase-3的表达,而3-MA预处理则可明显抑制艾塞那肽引起的LC3B-Ⅱ和caspase-3上调,但p62的表达却进一步上调.结论 艾塞那肽可诱导AR42J细胞凋亡,3-MA可通过抑制自噬而抑制艾塞那肽诱导的凋亡.使用3-MA可作为减轻艾塞那肽对胰腺腺泡细胞毒性的一种潜在方法.
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小豆蔻明调控自噬抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的研究
目的:卵巢癌为女性常见病,死亡率高,分子靶向治疗药物较少,研发高效低毒的靶向新药意义重大.细胞自噬(autophagy)维持着细胞内稳态和生长,是抗癌药物作用的关键靶部位.本课题旨在明确小豆蔻明(Cardamonin,CAR)调控自噬对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响.方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞,不同药物分组处理,荧光显微镜下观察单黄酰戊二胺(MDC)染色后细胞自噬囊泡,Western Blot法检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达,四氮唑蓝(MTT)法观察SKOV3细胞增殖情况,流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡的变化.结果:自噬抑制剂3-MA显著性降低SKOV3细胞内MDC染色的荧光颗粒数目、LC3 Ⅱ蛋白表达,抑制细胞增殖;而CAR(高、中剂量)、雷帕霉素和AZD8055与3-MA联用后细胞内MDC荧光颗粒数目增多、LC3 Ⅱ蛋白表达增加、细胞增殖抑制率及凋亡率明显升高;且高剂量CAR(10-5 mol·L-1)的作用比低剂量CAR(10-6 mol·L-1)明显.结论:CAR能够抑制SKOV3细胞增殖,诱导细胞自噬,促进细胞凋亡.CAR有望成为卵巢癌药物治疗的先导化合物.本研究为进一步研发此类化合物提供了实验依据及一定的理论基础.
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姜黄素对白血病K562细胞增殖抑制作用的研究
目的:探讨姜黄素(curcumin)对白血病K562细胞增殖抑制的作用机制.方法:采用MTT法测定curcumin对K562细胞增殖的抑制作用;分别应用AO/EB和MDC荧光染色观察给药后凋亡和自噬的发生;检测LDH漏出率以观察用自噬特异性抑制剂3-MA后curcumin抑瘤作用的变化.结果:curcumin可显著抑制K562细胞生长,诱导其发生自噬和凋亡;给药后阻断自噬其细胞毒性作用减弱.结论:curcumin能诱导白血病K562细胞的自噬和凋亡从而提高了抗癌的敏感性.
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自噬在熊果酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖中的作用
[目的]分析自噬在熊果酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖中的作用.[方法]体外培养人宫颈癌HeLa细胞,不同浓度(5、10、20μmol/L)的熊果酸处理48h后,采用MTT法检测HeLa细胞增殖抑制率的变化;透射电镜观察细胞自噬超微结构的改变;Western blotting检测自噬相关蛋白p62及Beclin-1的表达情况;微管相关蛋白1轻链3A/B (microtubule-associated protein 1 light chain 3 A/B,LC3A/B)免疫荧光检测熊果酸对HeLa细胞自噬水平的影响;检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬前后对熊果酸增殖抑制作用的影响.[结果]不同浓度(5、10、20 μmol/L)的熊果酸处理组对HeLa细胞的抑制率分别为20.1％±1.3％、35.6％±2.6％和49.0％±1.0％,熊果酸可抑制HeLa细胞增殖并呈剂量依赖性(=446.177,P＜0.001);熊果酸能诱导HeLa细胞发生自噬:透射电镜观察发现经熊果酸处理后HeLa细胞中自噬囊泡明显增加;Western blotting分析表明熊果酸可呈剂量依赖性增加Beclin-1的表达,降低p62的表达;免疫荧光检测显示熊果酸处理后,HeLa细胞的荧光强度与对照组相比明显增强;3-MA与熊果酸联合作用于HeLa细胞时可抑制细胞增殖.[结论]熊果酸抑制HeLa细胞增殖,并诱导其发生自噬,自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸对HeLa细胞的增殖抑制作用.
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自噬在孤独症模型大鼠行为学及海马PSD-95蛋白表达变化中的作用
目的 观察孤独症大鼠自噬干预前后突触相关蛋白的表达变化,探讨自噬在孤独症大鼠突触发育中的作用.方法 采用母孕期化学干预法于Wistar鼠孕12.5 d(E12.5)给于腹腔注射丙戊酸钠(VPA),其子代为孤独症模型组,同样方法在孕鼠E12.5腹腔注射同等剂量生理盐水,其子代为正常组,通过自梳理实验、三箱实验验证模型是否成功.在出生后35～42 d(P35 ～ P42)从孤独症模型中随机取30只分为三组:自噬增强组(Rap组),腹腔注射雷帕霉素(5 mg/kg);自噬抑制组(3-MA组),腹腔注射3-methyladenine(5mg/kg);模型组,腹腔注射同等剂量的溶剂.运用三箱实验及自梳理实验对比自噬干预前后大鼠的社会行为变化,Western blot方法对比自噬干预前后孤独症大鼠P42自噬与突触相关蛋白的表达变化.结果 ①成功建立孤独症模型,自梳理实验显示,模型组理毛时间较正常组明显延长(P＜0.01),与模型组(治疗后)比较,Rap组理毛时间减少(P＜0.01),3-MA组理毛时间延长(P＜0.01);三箱实验显示,与正常组比较,模型组缺乏社会交往能力及对新鲜事物偏好能力,Rap组可改善该社会能力,而3-MA组则进一步加重;②与正常组比较,模型组大鼠P42海马LC3-Ⅱ、Beclin 1表达减少(P＜0.05)、PSD-95表达增加(P＜0.05);与模型组(治疗后)比较,Rap组大鼠P42海马LC3-Ⅱ、Beclin 1表达增加(P＜0.05),PSD-95表达减少(P＜0.05),而3-MA组则相反.结论 孤独症大鼠通增强自噬可调节突触发育,增强自噬可能是一个潜在的治疗方法.
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羟基喜树碱对人肺癌A549细胞自噬的影响
目的 探究羟基喜树碱(HCPT)对人肺癌A549细胞自噬的作用.方法 体外进行肺癌A549细胞的培养,分别使用50、200和400μmol的HCPT处理,利用MTT法检测HCPT对细胞存活率的影响;共聚焦显微镜成像技术观察HCPT对细胞自噬活性的影响;Western blot检测HCPT对自噬相关蛋白LC3、p-mTOR表达的影响.结果 HCPT抑制A549细胞的活性;HCPT处理24 h后细胞质和细胞核周围Cyto-ID绿色荧光强度增强;与对照组比较,HCPT治疗各组LC3II/I值升高,p-mTOR表达减少;且加入自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)处理后的各组与相对应的HCPT治疗各组比较,A549细胞的增殖抑制增强.结论 HCPT能抑制A549细胞增殖并诱导其发生自噬;HCPT发挥抑制A549细胞增殖作用可能与自噬密切相关;抑制细胞自噬可能会增强HCPT的抗A549细胞增殖能力.
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3-MA通过抑制自噬反应提高结肠癌5-FU的化疗效果
目的 探索新的联合化疗方案以提高5-FU为基础的结肠癌化疗效果.方珐 研究5-FU(7.5 μmol/L)、3-MA(5 mmol/L)以及两种药物联合使用对人结肠癌细胞株HCT116的自噬及凋亡影响.MTT、Hoechst+ PI染色检测细胞生长及凋亡,MDC染色观察细胞内自噬反应,Western blotting观察细胞内的凋亡及自噬相关蛋白改变.将HCT116细胞注射至裸鼠皮下建立在体肿瘤模型并进行治疗,观察肿瘤生长情况.结果 MTT检测结果显示HCT116在5-FU作用下细胞生长受到抑制,Hoechst+PI染色显示5-FU联合3-MA组凋亡数量较5-FU组明显增加;Western blotting检测5-FU联合3-MA组的凋亡蛋白Caspase-3、PARP表达较5-FU组明显增高.同时,MDC染色以及自噬特异性蛋白LC3II检测发现在5-FU作用下自噬反应升高,而通过3-MA抑制5-FU引起的细胞自噬反应,细胞生长抑制率从5-FU单独作用的(51.64±4.04)％提高至(79.89±1.35)％,凋亡增加超过100％.皮下注射HCT116细胞的裸鼠肿瘤模型,5-FU联合3-MA组较单独使用5-FU组有效抑制肿瘤生长,肿瘤体积及质量均明显减少.结论 3-MA可抑制5-FU处理引起的细胞自噬反应,促进细胞凋亡,HCT116细胞生长抑制率明显增加;为提高5-FU为基础的结肠癌化疗提供新思路.
