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鱼藤酮对SH-SY5Y细胞中核仁素、α-突触核蛋白和DJ-1相互作用的影响
目的 探索在鱼藤酮(Rotenone)染毒的SH-SY5Y细胞中,核仁素(Nucleolin,NCL)与两种已知与帕金森病(Parkinson Disease,PD)相关的基因α-Synuclein和PARK7(Parkinson disease protein7,又称DJ-1)编码的蛋白α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)和DJ-1的相互作用.方法 采用MTT法检测鱼藤酮(20、100和500 nmol/L)染毒SH-SY5Y细胞24 h和3d后对细胞存活率的影响;采用免疫荧光染色法(Immunofluorescent staining,IF)分别染色3种蛋白,在共聚焦显微镜下观察蛋白的亚细胞定位,分析3种蛋白在空间上的关系;采用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)和免疫蛋白印记(Western Blot,WB)法检测染毒前后核仁素分别与DJ-1和α-Synuclein的相互作用.结果 用鱼藤酮(20、100和500 nmol/L)染毒SH-SY5Y细胞24h后,各个染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);染毒3d后20 nmol/L染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05),而100和500 nmol/L染毒组细胞存活率改变与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).激光共聚焦分析显示D J-1和核仁素分布于SH-SY5Y细胞核和细胞质中,而α-Synuclein分布于细胞质中,核仁素与DJ-1和α-Synuclein都有共定位.鱼藤酮染毒SH-SY5Y细胞前后,核仁素分别与D J-1和α-Synuclein免疫共沉淀后,免疫蛋白印迹结果显示核仁素与二者均可形成蛋白复合体.结论 在SH-SY5Y细胞中核仁素与DJ-1和α-Synuclein都存在蛋白-蛋白相互作用,染毒鱼藤酮后核仁素与DJ-1和α-Synuclein的相互作用并没有消失,提示核仁素可能是帕金森病相关蛋白.
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应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子
目的 蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚.因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索.方法 以小鼠卵巢组织cDNA为模板,构建pGBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测pGBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达.将人卵巢cDNA文库与含有pGBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系.结果 酶切鉴定和Blast分析表明pGBKT7-Pkmyt1质粒构建成功.将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Westernblotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达.PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段.通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白.结论 通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育.
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G蛋白信号调节因子的结构分类和功能
G蛋白信号调节因子是能够直接与激活的Gα亚基结合,显著刺激Gα亚基上的GTP酶活性,加速GTP水解,从而灭活或终止G蛋白信号的一组分子大小各异的多功能蛋白质家族.它们都共同拥有一个130个氨基酸的保守的RGS结构域,其功能是结合激活的Gα亚基,负调节G蛋白信号.许多RGS蛋白还拥有非RGS结构域,能够结合其它信号蛋白,从而整合和调节G蛋白信号之间以及G蛋白和其它信号系统之间的关系.
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以HIV-1 IN-LEDGF/p75相互作用为靶点的抑制剂筛选
目的 晶状体上皮源性生长因子 p75 蛋白(LEDGF/p75)与 HIV-1 整合酶(IN)之间的蛋白-蛋白相互作用是开发抗 HIV-1 药物的有效靶点,本文旨在寻找以 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用为靶点的小分子抑制剂.方法 采用均相时间分辨荧光技术(HTRF)筛选了 799 个化合物,比对 IN-LEDGF/p75 相互作用的抑制活性.结果 发现 5 个化合物——肾上腺酮、6-溴-1,2-二氢萘-1,2-二酮、头孢噻吩、根皮含柘树呫吨酮 L 和迷迭香酸对该相互作用表现出不同程度的抑制作用,其 IC50值分别为12.3、22.7、26.2、18.5 和 1.13 μmol/L.结论 为 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制剂的发现以及新的抗 HIV-1 药物的开发提供了重要基础.
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FasL相关蛋白SH3P12影响FasL细胞膜表达效应研究
目的 研究FasL相关蛋白SH3P12对FasL表达的影响.方法 构建SH3P12真核细胞表达载体,并与FasL共同短暂表达于人胚肾细胞293T细胞.以免疫共沉淀和免疫印迹法确定目的蛋白之间的相互作用,以免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察SH3P12与FasL在细胞内表达.结果 在转染的293T细胞中,SH3P12与FasL可形成免疫共沉淀的蛋白-蛋白复合物.荧光蛋白标记结合显微镜观察提示在无SH3P12存在时,FasL主要分布于293T细胞膜,并伴随部分蛋白表达在细胞内高尔基体或内含体样颗粒中;在有SH3P12存在时,FasL与SH3P12形成复合体,共同定位于细胞膜,此时细胞内表达FasL量明显降低.结论 SH3P12为FasL细胞内结合蛋白,其生物学活性可能为稳定FasL在细胞膜上的表达.
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MDM2抑制剂在泌尿系统肿瘤方面的研究进展
随着MDM2的发现,MDM2-P53相互作用机制的不断阐明和小分子MDM2抑制剂的进展,临床医师发现,应用MDM2抑制剂可阻断MDM2-P53的相互作用,提高P53的表达水平,从而起到治疗肿瘤的作用.本文结合国内外文献就MDM2抑制剂在治疗泌尿系统肿瘤时的作用机制及相关信号传导通路的研究进展作一综述.
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食管癌相关基因1编码蛋白的相互作用蛋白筛选
目的筛选与食管癌相关基因1(ECRG-1)编码蛋白相互作用的蛋白,为其功能研究奠定基础.方法将编码ECRG-1羧基端378个氨基酸的DNA序列插入到pGBKT7-DNA-BD载体,与编码Gal4 DNA结合结构域的DNA序列拼接做融合基因,将此重组质粒与已克隆到pACT2载体上的人肝脏cDNA文库(与编码Gal4激活结构域的DNA序列融合)共转化酵母细胞AH109.ECRG-1与相应的人肝脏cDNA片段编码的蛋白发生相互作用后,可激活报告基因的表达.排除假阳性后,阳性克隆中的文库cDNA进行测序分析.同源性检索搜寻GenBank中与之相同或相似的序列.结果共转化得到约3×106个转化子,23个克隆有报告基因的表达.排除假阳性后,得到2个阳性克隆,它们分别编码Miz-1(myc-interacting zn finger protein-1)和FLNA(actin-binding protein-280).结论 ECRG-1基因编码蛋白在酵母中可特异性的结合Miz-1和FLNA,提示ECRG-1可能通过与MIZ-1、FLNA相互作用参与调控细胞周期的运行.
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酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因
为克隆与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因,采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选.构建HCVNS3蛋白诱饵酵母质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.选择既能在4重营养缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上生长,又能在涂有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌后进行测序,并进行生物信息学分析.分析的结果显示,筛选出19个阳性克隆,包括已知功能基因17个,还有1个克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有44%的同源性,初步证明了此基因与HCV NS3有结合活性.说明成功克隆了HCV NS3蛋白结合蛋白基因,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索.
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订书肽的合成与活性研究进展
蛋白-蛋白相互作用(PPIs)在调节机体生命活动中起着决定性的作用,是体内众多信号传导通路的关键机制,其中很多关键蛋白质是可以利用的潜在药物靶点.探索有效调控蛋白-蛋白相互作用的方法,将对生理学以及药物研究大有裨益.绝大多数蛋白-蛋白相互作用以相对较大且较浅的作用面模式进行,小分子难以形成有效结合或调控.将蛋白-蛋白相互作用中以多肽二级结构为支撑骨架的折叠亚结构域中的α-螺旋肽单独提取出来,通过化学合成的方法加以构建将有可能得到选择性作用于靶标蛋白的活性多肽药物先导物.然而大部分多肽片段在离开蛋白质整体结构后将无法稳定形成结合所需的二级结构,而易于形成无规则卷曲构象从而导致结合活性下降,并且更易受肽酶的降解,无法直接成药.应用全碳骨架形成侧链环合结构改造多肽来稳定α-螺旋肽的活性构象,即订书肽(stapled peptide),成为克服这一缺陷的直接有效方法.该方法不仅可以提高其原本的蛋白结合活性,而且具有较高的代谢稳定性和细胞膜通透性.基于这些显著的优势,订书肽已经成为一类重要的活性多肽结构改造方式,也必将由此形成更多的以蛋白-蛋白相互作用为靶点的新型多肽药物.本文将着重综述并讨论通过化学手段合成订书肽的方法及其药理活性研究进展.
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Bcl-2:从靶标到上市药物的研究进展
细胞凋亡对正常生命体的发育、维持内环境的稳态具有重要作用,而该过程的异常常常会引发机体病变.研究表明Bcl-2蛋白家族与细胞凋亡过程密切相关,而且也是治疗肿瘤的重要靶标.经过近20年的努力,已经发现了许多小分子Bcl-2抑制剂.特别是基于片段药物设计策略发现的小分子Bcl-2抑制剂venetoclax已于2016年被美国FDA批准上市.作为首个获批的基于蛋白-蛋白相互作用为靶点的小分子药物,venetoclax的研发综合运用了多种药物研发技术,在新药研发的历史中具有里程碑式的意义.本文主要对临床研究的Bcl-2抑制剂的研发历程进行简述.
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基于均相时间分辨荧光技术(HTRF)的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法的构建及其应用
热休克蛋白90 (HSP90)是细胞内大量表达的一类蛋白,其主要功能是辅助细胞内其他蛋白(客户蛋白)的成熟.HSP90的众多客户蛋白与肿瘤的发生发展有重要的关系,因此抑制HSP90的功能可以使这些癌症相关蛋白降解,从而诱导肿瘤细胞凋亡,达到治疗肿瘤的目的.HSP90在发挥功能时还需要与辅伴侣蛋白HOP相互作用,因此靶向HSP90-HOP的相互作用开展抑制剂研发成为抑制HSP90伴侣系统的新策略.本文基于均相时间分辨荧光技术(HTRF)构建了稳定的用于测试HSP90-HOP相互作用抑制剂活性的方法,并用该方法研究了HSP90 C-端五肽MEEVD及其突变肽段对HSP90-HOP相互作用的抑制活性,为新型HSP90-HOP相互作用抑制剂的筛选和发现提供了重要基础.
关键词： 热休克蛋白90 HOP 均相时间分辨荧光技术 蛋白-蛋白相互作用 -
蛋白-蛋白相互作用:抗肿瘤药物研发的新方向
肿瘤基因组学、靶向治疗和肿瘤生物学的研究进展明确了蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)在肿瘤发生发展中起着重要的作用,为抗肿瘤药物的研发提供了一个新的方向.然而,基于PPI的小分子药物研发面临着作用界面较大、结合口袋较浅等问题,使得基于PPI的药物开发极具挑战.近年来,PPI“热区”概念的提出,为基于PPI的小分子抑制剂的开发带来了新的思路.拟肽设计、片段筛选等药物发现策略的综合应用,丰富了PPI抑制剂开发的技术手段.由靶标验证(基于基因组学)、药物设计(基于PPI热区)以及临床研究(基于患者基因亚群)构成的三位一体开发模式逐步成形.可以预见,基于PPI的药物研发,将进一步促进肿瘤个体化医疗的发展.本文系统介绍了基于PPI发现抗肿瘤药物的方法,并对MDM2/p53,IAP,Bcl-2等热门靶标进行简要小结.
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基于Menin-MLL相互作用的小分子抑制剂的研究进展
多发性内分泌腺瘤1型基因编码蛋白(Menin)与混合谱系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)融合蛋白之间的相互作用可导致急性白血病,该蛋白复合物通过调控同源异型基因(HOX)的表达,导致造血干细胞的分化能力出现障碍,继而造成MLL易位型白血病,即混合谱系白血病.有研究发现,有几类小分子化合物可以占据Menin蛋白上的MLL结合口袋,干扰Menin-MLL之间的相互作用,这一发现为此类急性白血病的治疗提供了一种新的思路.本文主要介绍Menin-MLL之间蛋白-蛋白相互作用的机制以及目前几种有前景的Menin小分子抑制剂.
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抗肿瘤药venetoclax的研发和启示
抑制蛋白-蛋白相互作用(PPI)的小分子药物向来是新药研发的难题,雅培公司创制的venetoclax是第一个真正意义上的PPI抑制剂.该药研发20年,历尽曲折与风险.本文从药物化学的视角简要介绍其研发过程.Venetoclax的研制涉及多种技术方法,包括用核磁共振(SAR by NMR),基于片段的药物发现(FBDD),X-射线晶体学指导基于蛋白结构的分子设计以及集中库的设计等.研发中两次更改靶标,由单一的靶标Bcl-xL蛋白改换成双靶标Bcl-xL/Bcl-2,后聚焦为Bcl-2蛋白,彰显出研发的巨大风险性,见证了确证靶标的可药性(druggability)贯穿于从先导物到临床试验的全过程.作为口服治疗慢性淋巴白血病的药物,Venetoclax的创新性还表现出化学结构突破了“类药5规则”的限制,分子量为882的化合物足以屏蔽掉两个蛋白的结合热域(hot spots)也体现了构建化学结构的成功.
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一种新的研究蛋白相互作用的技术--串联亲和纯化
蛋白质组学的发展及分析技术的进步,客观上要求建立新的生物纯化策略.串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)是一项新的纯化蛋白复合物的技术,它与质谱技术结合使用,已成为当前蛋白质组学研究的重要工具.本文从该技术的每一层面入手,对此方法的研究进展进行概述.
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蝎毒素与小电导钙激活钾通道独特的相互作用
分布在神经系统中的小电导Ca2+激活钾通道(small conductance Ca2+-activated potassium channels,SK通道)在学习、记忆及突触的可塑性过程中发挥了重要的作用.利用短链蝎毒素揭示了SK通道大部分药理学性质.不同于大部分电压门控钾通道和大电导Ca2+激活钾通道,SK通道电流仅能被少量蝎毒素抑制.近来,研究揭示了SK通道选择性识别毒素的结构基础是SK通道细胞外孔区部位存在一种新颖的多肽筛选器.本综述总结了蝎毒素与SK通道独特的相互作用,这不仅对深入研究SK通道生理功能具有重要的作用,而且有助于促进SK通道相关疾病的药物开发.
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靶向HIF-1α/p300蛋白-蛋白相互作用抑制剂的研究进展
缺氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)是肿瘤适应缺氧微环境的重要调节因子.它调控细胞增殖与存活、新陈代谢、血管生成、入侵与转移等相关行为的100多个靶基因,而HIF-1 α/p300是调控这些下游基因表达的重要复合物,靶向HIF-1 α/p300蛋白-蛋白相互作用展开抑制剂的开发成为抗肿瘤药物研究的又一热点.本文对HIF-1α信号通路、HIF-1α/p300蛋白-蛋白相互作用的结合模式以及近年HIF-1 α/p300蛋白-蛋白相互作用抑制剂的研究进展进行了综述,为该类抑制剂的设计提供参考.
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靶向Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂的研究进展
热休克蛋白90 (Hsp90)参与肿瘤生理与病理的多个过程,设计与开发有效的Hsp90抑制剂一直是抗肿瘤药物研发的热点.目前,传统的N端抑制剂的研发正处于瓶颈期,C端抑制剂的发展也受到了限制,阻碍Hsp90与细胞分裂周期蛋白Cdc37的相互作用已经成为了抑制Hsp90的全新方向.研究表明,很多的蛋白激酶需要依靠Cdc37而聚集到Hsp90上,从而完成空间构象的正确折叠.因此,靶向Hsp90-Cdc37能够具有针对性地抑制Hsp90的激酶类客户蛋白,降低不良反应.随着对Hsp90与Cdc37相互作用机制越来越深入的研究,很多能够干扰Hsp90-Cdc37的天然产物被发现,本文从发现过程、作用机制这两方面综述这些小分子抑制剂的研究进展.
关键词： 热休克蛋白90 细胞周期分裂蛋白37 蛋白-蛋白相互作用 进展 -
HIV进入抑制多肽VIR576与TCR的相互作用研究
目的 VIR576为具有抑制HIV进入靶细胞活性的抗艾滋病多肽,我们发现其能抑制抗原特异性T细胞活化,且可能是通过与T细胞受体(TCR)结合而发挥作用.本研究深入探讨VIR576与T细胞受体(TCR)相互作用,并确定其关键作用位点.方法 采用荧光化合物标记多肽,用荧光共振能量转移技术(FRET)来检测VIR576与TCR的相互作用,并通过合成TCR跨膜序列(TCR-TMD)的核心多肽(CP),确定相互作用的关键序列.同时用激光共聚焦显微镜,观察VIR576在T细胞膜上是否与TCR存在共定位.结果 FRET分析表明VIR576能与CP多肽发生近距离的相互作用.VIR576能插入到细胞膜上,并结合在抗CD3-抗体活化的小鼠脾细胞膜上,与CD4分子分布一致,提示其与TCR分子存在共定位.结论 VIR576可能在激活的T细胞上与TCR跨膜区直接结合,结合的关键位点为TCR跨膜区的核心序列CP.
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荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证
目的 构建携带FRET体系( YFP-CFP对)的一组原核表达工程质粒,在大肠杆菌( E. coli)中高效表达后,验证该体系FRET信号作为细胞内监测蛋白相互作用指标的可行性.方法 分别构建 N端、C端以及两端分别编码 YFP和(或) CFP 的 6 个原核表达工程质粒: pNYFP、 pCYFP、pNCFP、 pCCFP、 pYFP-CFP、 pCFP-YFP.设计 YFP-CFP 和CFP-YFP作为阳性对照,而等量的YFP与CFP混合的体系(YFP + CFP)作为阴性对照.将过表达的工程蛋白通过镍柱、分子筛层析柱进行初步纯化后使用酶标仪检测相同摩尔浓度纯化蛋白的FRET信号.在此基础上,进一步用酶标仪检测表达工程蛋白的菌液中的FRET信号.结果 通过测序验证,成功构建了6个原核表达的工程质粒.酶标仪检测的结果显示在体外纯化蛋白条件和菌液条件下均可产生明确的FRET信号.结论 成功构建了FRET体系的原核表达工程质粒,不仅验证了蛋白条件下的可行性,而且验证了菌液条件下的可行性,为在活细胞条件下对蛋白-蛋白相互作用进行实时的动态研究,提供一个非常便利的实验方法.
