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恶性疟原虫Pf332分子DBL、TM和WR功能区蛋白质的转运分析
目的 分析恶性疟原虫Pf332分子的DBL、TM和WR 3个功能区蛋白质在虫体内的表达和分布以及与肌动蛋白的结合情况,探讨其在感染红细胞内的转运过程及功能,为进一步研究疟原虫侵入机制及筛选红内期疫苗候选抗原提供理论依据.方法 将构建融有GFP基因的恶性疟原虫Pf332分子的Pf332DBL-GFP、Pf332TM-GFP和Pf332WR-GFP重组质粒分别转染到3D7虫株恶性疟原虫,通过活体荧光实时观察DBL、TM和WR蛋白质表达及其在染虫红细胞内的分布,运用间接免疫荧光共定位方法观察蛋白质DBL、TM和WR与肌动蛋白的结合情况.结果 转染试验表明,重组DBL-GFP、TM-GFP和WR-GFP基因能在虫体中正常表达蛋白质,该蛋白均分布在染虫红细胞的纳虫泡内,但未能转运到红细胞的胞浆内.间接免疫荧光共定位表明恶性疟原虫Pf332分子的DBL、TM和WR等3个功能区蛋白质均未与肌动蛋白(β-actin)结合.结论 Pf332分子的DBL、TM和WR等3个功能区蛋白在单独表达后自身均不能发生跨膜反应,即不能通过虫体的纳虫泡膜.南此推测,Pf332分子在虫体内合成后很可能通过多个功能基团协同作用转运到红细胞膜部位.
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恶性疟原虫蛋白输出机制的研究进展
疟疾是由疟原虫引起的虫媒传染病.近些年,由于疟原虫抗药性的产生和迅速扩散,给疟疾治疗带来严重困难,因此,研制安全有效的疫苗是预防疟疾感染,控制疟疾流行的主要手段之一.疟原虫致病机制研究已经成为研制抗疟疫苗及疾病防控的一项重点,由于多种疟原虫输出型蛋白能够运输到宿主细胞表面进行信息传递并可使虫体逃避宿主的免疫反应,因此研究虫体输出型蛋白转运机制对疟原虫致病机制研究有着至关重要的意义.本文概述了疟原虫蛋白输出的机制,以及NPPs、TVN、MCs、Knobs和PTEX等5种疟原虫重要的蛋白输出结构的研究进展.
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Tat融合蛋白表达载体TAT-SOX2的克隆化及蛋白表达研究
目的 构建重组表达载体TAT-SOX2,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白.方法 经PCR获得编码人SOX2的全基因序列,连接到原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-SOX2,转化大肠埃希菌,IPTG诱导TAT-SOX2融合蛋白的表达.表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导HSF细胞的效果.结果 成功构建了TAT-SOX2融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内.结论 为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础.
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FasL相关蛋白SH3P12影响FasL细胞膜表达效应研究
目的 研究FasL相关蛋白SH3P12对FasL表达的影响.方法 构建SH3P12真核细胞表达载体,并与FasL共同短暂表达于人胚肾细胞293T细胞.以免疫共沉淀和免疫印迹法确定目的蛋白之间的相互作用,以免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察SH3P12与FasL在细胞内表达.结果 在转染的293T细胞中,SH3P12与FasL可形成免疫共沉淀的蛋白-蛋白复合物.荧光蛋白标记结合显微镜观察提示在无SH3P12存在时,FasL主要分布于293T细胞膜,并伴随部分蛋白表达在细胞内高尔基体或内含体样颗粒中;在有SH3P12存在时,FasL与SH3P12形成复合体,共同定位于细胞膜,此时细胞内表达FasL量明显降低.结论 SH3P12为FasL细胞内结合蛋白,其生物学活性可能为稳定FasL在细胞膜上的表达.
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胆固醇酯转移蛋白TaqIB基因多态性与辛伐他汀对冠心病患者血脂调节作用的关系
目的:探讨胆固醇酯转移蛋白TaqlB基因多态性与辛伐他汀对冠状动脉(冠脉)粥样硬化性心脏病患者血脂调节作用的关系.方法:对147例急性冠脉综合征(ACS组)患者、99例稳定冠心病(组)患者及42例经冠脉造影排除冠心病的患者(对照组)进行研究.采用酶法测定血脂各项水平,采用多聚酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性分析冠心病患者胆固醇酯转移蛋白基因中TaqlB基因多态性.冠心病患者予辛伐他汀调脂3个月后复查血脂.采用方差分析法比较TaqIB基因组间调脂疗效有无差异.结果:血浆血脂水平变化:可见ACS组与稳定冠心病组血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及脂蛋白(a)水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05～0.01).辛伐他汀调脂治疗前后对冠心病患者血脂水平的影响:可见经辛伐他汀治疗3个月后,血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯(仅B282)、脂蛋白(a)(tZ BlB2)水平较治疗前均降低,差异有统计学意义(P<0.05～0.01).冠心病患者胆固醇酯转移蛋白TaqIB基因型与等位基因对辛伐他汀调脂作用的影响:132132组患者经辛伐他汀调脂治疗后,血浆甘油三酯有了显著降低,且与B1携带者(包括B182组和B1B1组)差异有统计学意义(P<0.01).结论:基因型B182与B1B1比较,血浆高密度脂蛋白胆固醇水平显著增高.B2B2患者经辛伐他汀调脂治疗后,血浆甘油三酯水平显著降低.提示辛伐他汀对冠心病患者的血脂调节作用与胆固醇酯转移蛋白Taq IB基因多态性具有相关性.
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脂蛋白脂酶S447X和胆固醇酯转运蛋白TaqIB基因多态性与冠心病的关系
目的探讨脂蛋白脂酶(LPL)基因S447X和胆固醇酯转运蛋白(CETP) TaqIB与冠心病的关系.方法对249例经冠状动脉造影证实为冠心病的患者及167例经冠状动脉造影证实无冠状动脉病变的对照者进行研究,采用酶法测定血脂各项水平,采用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析LPL基因中S447X及CETP基因中TaqIB的基因多态性.结果冠心病组与对照组比较,LPL S447X和CETP TaqIB基因型与等位基因频率分布无显著性差异,P>0.05.甘油三酯≥1.7 mmol/L时,B2B2组高密度脂蛋白胆固醇水平升高,P<0.05.甘油三酯<1.7 mmol/L时, SX/XX组血脂各项与SS组比较均有显著性差异,P<0.05;B2B2组高密度脂蛋白胆固醇水平升高, P<0.05.在B1B1基因型中,当S突变为X时,血浆总胆固醇和甘油三酯水平明显降低,P<0.05;在B1B2基因型中,当S突变为X时,血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平下降,P<0.05;在B2B2基因型中,当S突变为X时,血浆高密度脂蛋白胆固醇水平明显升高,P<0.01.结论 S、X、B1 、B2等位基因频率的分布在冠心病组及对照组之间无明显差异.
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TAT-EGFP融合蛋白的表达及其在小鼠体内跨膜转导与分布的研究
目的:建立TAT-EGFP融合蛋白在原核细胞中表达的试验方法,探讨该融合蛋白经过胎盘屏障后在小鼠体内跨越各种生物膜转导及分布情况.方法:将重组表达栽体pET32-TAT-EGFP转化E ColiBL21,得到稳定表达的融合蛋白,纯化后注入孕鼠腹腔内,注射后第3天分别取母鼠和仔鼠组织,并做快速冷冻切片,观察融合蛋白在小鼠体内的分布.结果:成功表达了相对分子质量为32×103的TAT-EGFP融合蛋白.该融合蛋白能在小鼠不同组织细胞内分布,在小肠上皮分布为明显, 并能透过胎盘及血脑屏障.结论:TAT介导的EGFP可在小鼠体内广泛跨膜转导分布,为进一步研究其他大分子活性物质进入细胞及其功能奠定了良好基础.
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细胞质内缝隙连接蛋白在肿瘤进展过程中的功能
缝隙连接细胞间通讯在维持组织稳态、调控细胞分化和肿瘤发生中发挥重要作用.研究证实缝隙连接介导的细胞间通讯抑制肿瘤的发生,在各种肿瘤组织中均发现有不同程度的细胞间缝隙连接通讯水平的下调,或由于缝隙连接蛋白表达减弱或缺失,或由于缝隙连接蛋白的细胞质内异位表达.长期以来普遍认为细胞质内缝隙连接蛋白表达只是引起细胞间缝隙连接通讯水平的下降,但是近的一些研究陆续发现,细胞质内缝隙连接蛋白蓄积在肿瘤的进展过程中,发挥着不依赖于细胞间缝隙连接通讯的独特生物学功能.
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采用IP-XL/MS技术研究SGC7901胃癌细胞中EGFR信号通路动态变化
目的 研究胃癌细胞在表皮生长因子(EGF)刺激下表皮生长因子受体(EGFR)相互作用蛋白的时序性变化.方法 筛选高表达EGFR的胃癌细胞系;EGF刺激不同时间后,利用甲醛固定免疫沉淀联合质谱(IP-XL/MS)技术对胃癌细胞中EGFR相互作用蛋白表达谱进行无标定量,捕获EGFR网络的动态变化.结果与结论 8种胃癌细胞系中,SGC7901细胞表达EGFR量高. 4次生物学重复实验,共鉴定到3728个蛋白,625个EGFR相互作用蛋白,包括已知的相互作用蛋白( GRB2、CBL、SHC1 等) ,并发现59 个新蛋白( ANKFY、LGR4、SNX3、VPS26 A、ZFYVE20等). ANOVA检验分析得到406个响应EGF刺激的差异表达蛋白,根据动力学变化可分成5个簇,其具有不同的生物学功能,如蛋白转运、內吞、囊泡循环和蛋白酶体输运等,共同参与EGFR信号传递的动态调控,交叉调节多条信号通路.
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介导感觉生理功能的瞬时受体电位通道蛋白(TRP)家族研究进展
瞬时受体电位通道蛋白(TRP)家族由一类特殊的阳离子通道蛋白组成,在神经细胞及其他非兴奋细胞中有重要作用,其中在介导多种感觉生理功能方面的作用尤其显著.TRP结构与功能的深入研究为阐明感觉生理功能的分子机制提供了重要线索.本文综述TRP家族在温度感受、机械刺激感受、光感受和化学信号感受等方面的研究进展.
关键词： 瞬时受体电位通道蛋白家族 感觉生理 信号转导 蛋白质转运 -
可穿越血脑屏障的新型神经生长因子TAT-BDNF神经保护作用研究
目的 研究合成的新型神经生长因子TAT-BDNF融合蛋白兼具穿越血脑屏障及神经保护双重活性,为使用功能蛋白质治疗中枢神经损伤提供研究基础.方法 采用分子克隆方法构建表达载体胡AT.HA-BDNF,原核表达获得TAT-BDNF融合蛋白.利用体外培养的大鼠大脑皮层神经元谷氨酸兴奋性损伤模型,通过检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,免疫荧光染色观察TAT-BDNF的神经保护作用.尾静脉注射TAT-BDNF后,通过免疫组化检测其穿透血脑屏障的活性;Nissl染色验证TAT.BDNF急性脊髓压迫损伤神经保护作用.结果 TAT·BDNF融合蛋白由重组质粒能有效表达.在神经元谷氨酸损伤模型中,使用TAT-BDNF后各组间培养液中LDH的漏出量差异有统计学意义(F=24 27,P＜0 05).形态学观察显示,TAT.BDNF可改善神经元的存活状态,减少谷氨酸诱导的细胞凋亡坏死比例(t=4.59,P:0 001).大鼠体内实验显示TAT-BDNF能有效透过血脑屏障,分布于脑与脊髓组织.脊髓损伤7 d后Nissl染色显示TAT-BDNF注射组髓内神经元存活状态优于对照组.结论 合成的新型神经生长因子TAT-BDNF具有穿透血脑屏障活性及神经保护作用.
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食管鳞癌组织中前列腺跨膜蛋白的表达和临床意义
目的 探讨食管鳞癌组织及食管正常组织中雄激素诱导的前列腺跨膜蛋白1(PMEPA1)的表达情况,并分析其与食管鳞癌临床病理之间的关系.方法 230例食管癌患者均来自河南省林州市.利用组织微阵列技术,采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物(ABC)法,分析230例食管鳞癌组织(观察组)和相应正常食管组织(对照组)中PMEPA1的表达情况,并探讨其与食管鳞癌患者年龄、性别、肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移、临床病理分期(TNM)分期和大体分型的关系.结果 观察组中PMEPA1蛋白表达明显高于对照组PMEPA1蛋白表达(80.0％ vs14.3％,P＜0.01)；PMEPA1蛋白高表达与淋巴结转移、TNM分期有关,而与年龄、性别、肿瘤细胞分化程度、和大体分型无关.结论 PMEPA1蛋白的异常表达可能在食管鳞癌的发生、发展及预后中起重要作用.
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七氟醚麻醉对老龄大鼠海马含GluR2亚基的AMPA受体转运的影响
目的 探讨七氟醚麻醉对老龄大鼠海马含GluR2亚基的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体转运的影响.方法 健康雄性老龄Wistar大鼠68只,18 ～ 20月龄,体重600 ～ 650g,采用随机数字表法,将其分为2组(n=34):对照组(C组)和七氟醚组(S组).S组行开放性胫骨骨折手术,吸入3.6％七氟醚2h进行麻醉.于术后1、3、7d进行场景恐惧记忆实验、声音提示恐惧记忆实验和Y迷宫实验,采用Western blot法测定海马总蛋白及膜蛋白含GluR2亚基的AMPA受体表达,并计算膜蛋白与总蛋白该受体表达水平的比值(m/t比值).结果 与C组相比,S组术后1和3d场景恐惧记忆实验僵直时间百分比和自发交替百分比降低,海马膜蛋白含GluR2亚基的AMPA受体表达下调,m/t比值降低,术后1-7 d声音提示恐惧记忆实验僵直时间百分比降低(P＜0.05).结论 七氟醚麻醉诱发老龄大鼠术后学习记忆功能障碍的机制与促进海马含GluR2亚基的AMPA受体从胞膜向胞浆转运有关.
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Stargazin在切口痛大鼠脊髓背角GluR1-AMPA受体胞浆至胞膜转运中的作用
目的 评价Stargazin在切口痛大鼠脊髓背角含谷氨酸受体1亚基的使君子酸(GluR1-AMPA)受体胞浆至胞膜转运中的作用.方法 成年雄性清洁级SD大鼠45只,体重280 ～ 300 g,6～8周龄,采用随机数字表法,将其分为5组:正常对照组(C组)、假手术组(S组)、切口痛+生理盐水组(P组)、切口痛+ Stargazin小干扰RNA(siRNA)组(I组)和切口痛+Stargazin无意义siRNA组(N组).P组、I组和N组分别鞘内注射生理盐水10μl、20 μmol/L siRNA、20μmol/L无意义siRNA 10μl,2次/d,连续3d,4d后制备右足底切口痛模型.切口痛术后3h时测定大鼠累计痛评分(CPS)和机械缩足阈(PWT).然后处死大鼠,取L3-6节段脊髓背角,采用Westem blot法检测胞浆和胞膜GluR1和GluR2亚基表达,采用免疫共沉淀技术检测脊髓背角Stargazin与GluR1或GluR2亚基的共表达.结果 与C组比较,P组和N组CPS评分升高,PWT降低,脊髓背角胞浆GluR1表达下调,脊髓背角胞膜GluR1表达上调,I组CPS评分升高(P＜0.05或0.01)；与P组比较,I组CPS评分降低,PWT升高,脊髓背角胞浆GluR1表达上调,脊髓背角胞膜GluR1表达下调,脊髓背角Stargazin和Stargazin与GluR1共表达下调(P＜ 0.05或0.01).结论 Stargazin介导了切口痛大鼠GluR1-AMPA受体从胞浆至胞膜转运.
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NPHS1两种新突变蛋白分子的细胞内分布
目的:研究NPHS1两种新突变编码蛋白在细胞内的分布与先天性肾病综合征发病机制的关系.方法:构建野生型和两种突变型NPHS1克隆,并转染至COS7细胞内,应用免疫荧光双标记的方法,分别进行细胞内及细胞表面的荧光标记,通过共聚焦显微镜对裂隙膜分子Nephrin在细胞内的分布进行研究.结果:野生型Nephrin表现为细胞内和细胞膜染色模式;V822M和C265R则主要为细胞内内质网染色模式,细胞膜着色几乎缺失.结论:突变的Nephrin蛋白由于错误折叠,不能由内质网被输送至细胞表面,这可能是先天性肾病综合征发病的机制之一.
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精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸与核糖核酸酶修饰碲化镉量子点探针对黑素瘤A375细胞的靶向研究
目的 制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)与核糖核酸酶(RNase A)修饰的碲化镉(CdTe)量子点(quantum dot,QDs)的纳米探针,观察其对恶性黑素瘤A375细胞的靶向效果.方法 利用微波加热方法得到核糖核酸酶修饰的碲化镉量子点(CdTe RQDs),再化学键合偶联RGD多肽得到RGD-CdTe RQDs纳米探针,通过透射电镜、粉末晶体衍射、荧光光谱仪和紫外吸收光谱仪检测其相应物理和光学表征.体外培养A375细胞,通过SPSS软件统计分析MTT实验结果,确定用于细胞成像的RGD-CdTe RQDs探针浓度,与A375细胞共同孵育15 min,通过激光共聚焦显微镜荧光成像的结果研究RGD-CdTe RQDs纳米探针与A375细胞之间结合的特异性.结果 用微波加热方法制备分散性和生物相容性好的CdTe RQDs纳米探针,通过化学偶联成功构建RGD-CdTe RQDs纳米探针,MTT实验结果表明,用20、40、80 nmol/L的RGD-CdTe RQDs探针与A375细胞孵育12、24、36和72 h后,20 nmol/L的RGD-CdTe RQDs在12h内对A375细胞的生命活动影响低；选择20 nmol/L的RGD-CdTe RQDs进行荧光成像实验,发现偶联RGD多肽的CdTe RQD纳米探针对A375细胞有明显的主动靶向效果.结论 成功制备RGD-CdTe RQDs纳米探针,该荧光分子探针可以主动靶向A375细胞.
关键词： 黑色素瘤 量子点 分子探针 蛋白质转运 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 -
七种中药乙醇提取物及补骨脂素对人黑素瘤YUGEN8细胞酪氨酸酶的影响
目的探讨中药乙醇提取物对酪氨酸酶翻译后加工成熟及运输的影响.方法体外传代培养人无色素黑素瘤细胞YUGEN8,分别加入川芎等7味中药提取液及补骨脂素,利用蛋白免疫印迹、内切糖苷酶酶切及激光共聚焦显微镜亚细胞定位等方法,观察中药处理组细胞内酪氨酸酶的表达、成熟及内质网输出过程与阴性对照组的差异.结果与阴性对照组比,中药菟丝子及桃仁处理组细胞酪氨酸酶蛋白相对分子质量80000左右成熟片段表达增加,能够耐受内切糖苷酶酶切;共聚焦显微镜下,酪氨酸酶的分布超出了内质网固有蛋白--钙联接蛋白的标记范围.结论中药菟丝子及桃仁对黑素瘤细胞内酪氨酸酶的成熟、稳定及内质网输出具有一定促进作用.
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HIV Tat49-57增强人乳头瘤病毒16E7细胞毒性T细胞表位穿膜效应研究
目的探讨有穿膜序列HIV Tat49-57的人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位融合肽的跨膜能力及其影响因素.方法在HPV16E7 HLA-A2+/H-2kb+限制性CTL表位E749-57的N末端连接穿膜肽HIV Tat49-57序列,应用固相技术合成此融合肽,用间接免疫荧光与激光共聚焦显微技术,研究其穿膜能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其体外诱导特异性CTL杀伤效应.结果穿膜序列HIV Tat49-57可以有效促进HPV16E749-57表位肽进人BHK细胞胞浆,并呈时间、剂量依赖关系(P＜0.05);与原表位肽相比,该融合肽有显著地激发特异性CTL活性的能力.结论在原CTL表位基础上引入穿膜序列,可以使其更快速、更有效地进入活细胞胞浆,为HPV16肽疫苗的设计提供一种新的思路.
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全基因组预测Phenylobacterium zucineum HLK1T的外排蛋白
目的:通过搜索Phenylobacterium zucineum HLK1T全基因组编码蛋白的N-端信号肽,跨膜α-螺旋等外排信号来预测其外排蛋白.方法:应用SingalP V3.0、LipoP V1.0、Phobius和TMHMM 2.0对HLK1T基因组所编码的蛋白进行综合预测;对保守序列用手工方法进行搜索,预测Ⅳ型蛋白和TAT通路蛋白.对预测到的外排蛋白进行COG分类.结果:HLK1T基因组编码的3 861个蛋白中有1 378个(35.7%)为外排蛋白,其中以跨膜蛋白为多,共预测到735个(占总蛋白的19.0%,外排蛋白的53.3%).此外,它还编码499个Ⅰ型分泌蛋白(12.9%,36.2%)和101个脂蛋白(2.6%,7.3%),以及4个Ⅳ型蛋白和12个TAT通路蛋白.根据COG分类,这些外排蛋白中与无机离子转运和代谢相关的P蛋白以及功能未明的S蛋白为多.结论:HLK1T编码大量外排蛋白,这些蛋白可能在细菌与宿主的相互作用以及胞内寄生的过程中发挥重要作用.
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磷脂酰肌醇在蛋白质转运中的作用
细胞的极性是真核细胞的一个特征,要求脂质和蛋白质在细胞内合成后运送到浆膜的特定部位.细胞内蛋白质的运输包括两个重要的分选中心:高尔基体的成熟面(TGN)是蛋白质的输出中心,在这里蛋白质被包装入不同的转运载体,进而与内体或浆膜融合;另一个分选中心是再循环内体,再循环内体的蛋白质进入内体的不同亚区域,进而被运到不同的目的地.磷脂酰肌醇(PI)是细胞膜上的一类磷脂,肌醇基团的不同位置被磷酸化,可产生7种不同的磷脂酰肌醇脂,包括PI 3-磷酸[PI(3)P]、PI(4) P、PI(4,5) P2、PI(3,5) P2、PI(3,4,5) P3等.
