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过表达DJ-1减轻鱼藤酮引起MN9D细胞线粒体损伤和细胞凋亡
目的 观察过表达DJ-1蛋白能否保护MN9D细胞抵抗鱼藤酮所致的线粒体损伤和细胞凋亡.方法 在MN9D细胞中分别过表达野生型DJ-1(WT)和L166P突变型DJ-1 (L166P),随后给予鱼藤酮处理.MTTr法观察细胞活力、JC-1染色观察线粒体膜电位(△Ψm)以及流式细胞仪AnnexinV+PI染色和TUNEL染色观察凋亡.结果 单纯鱼藤酮处理组细胞活力下降48.2％±6.4％,而过表达WT时,加入鱼藤酮后细胞活力仅下降22.0％±3.7％(P＜0.05),过表达L166P组跟单纯鱼藤酮组无显著性差异；鱼藤酮引起MN9D细胞△Ψm下降,过表达WT则可以部分恢复△Ψm,L166P无此作用；过表达WT-DJ-1组凋亡率分别为5.4％和9.7％,较单纯鱼藤酮处理明显下降(P＜0.05),而转染L166P细胞凋亡率跟鱼藤酮组无差异,TUNEL实验证实了同样的结果.结论 过表达野生型DJ-1能缓解鱼藤酮对MN9D细胞的损伤,具有线粒体保护功能,减少细胞凋亡的发生,而突变型L166P则无此作用.
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慢病毒载体介导下DJ-1过表达细胞模型的建立
目的 构建人野生型DJ-1及其L166P突变体的慢病毒载体并探讨慢病毒载体在构建基因过表达细胞模型中的作用.方法 分别构建野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1慢病毒载体质粒.进行测序确定比对正确后,进行质粒的大量扩增与制备并转染包装细胞系HEK293T细胞,荧光法和Western blot检测野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1在细胞系中的表达.在确定目的蛋白正确表达之后,大量转染HEK293T细胞进行包装并生产携带目的基因的慢病毒颗粒.测定病毒上清滴度后感染PC12细胞,荧光显微镜和Western blot观察GFP荧光强度以及目的蛋白的表达,确定病毒的感染效率.结果 成功构建携带DJ-1野生型及其突变体的慢病毒载体.该病毒载体可以转染进入HEK293T细胞内且目的蛋白能够正确表达.LV-DJ-1与LV-DJ-1/L166P的病毒滴度分别为2×109 TU/mL与2×108 TU/mL.病毒上清可以高效感染PC12细胞,绝大多数细胞可表达目的蛋白.外源野生型DJ-1和L166P突变体的蛋白表达量分别是内源性含量的315%和285%.结论 慢病毒感染细胞效率很高,是很好的制备基因过表达细胞的方法.通过慢病毒载体介导,本研究获得了DJ-1及其突变体的过表达细胞模型.该模型可以用于后续DJ-1功能研究.
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MicroRNA在建立DJ-1基因敲减细胞模型中的应用
目的 与传统的siRNA方法建立基因敲减模型不同,探讨合成microRNA(miRNA)在DJ-1基因敲减细胞模型中的应用.方法 构建针对DJ-1基因的合成miRNA载体,合成DJ-1基因的siRNA干扰片段.在脂质体介导下,将上述两种小干扰RNA载体或片段分别转染MN9D细胞系,应用real-time PCR和Western blot检测目的 基因DJ-1的mRNA和蛋白表达.结果 与对照组相比,转染合成microRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调90%(P<0.05),蛋白水平下调70%～85%(P<0.05);而转染siRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调50%～70%(P<0.05),蛋白水平下调20%-50%(P<0.05).结论 microRNA与siRNA均可作为基因敲减的重要研究手段.与传统的siRNA相比,合成microRNA对目的 DJ-1的干扰效率更为显著.
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DJ-1拮抗ROS介导Beclin-1上调在缺氧复氧HL-1心肌细胞中的作用
目的 探讨D J-1拮抗氧化应激诱导过度自噬在缺血再灌注心肌损伤中的保护机制.方法 以慢病毒为shRNA DJ-1载体感染心肌HL-1细胞系构建缺氧复氧损伤模型.Western blot检测shRNA DJ-1沉默效率和LC3、Beclin-1和DJ-1蛋白表达,流式细胞术Annexin Ⅴ和PI染色分别检测凋亡和坏死,MDC和DCFH-DA染色分别检测细胞内自噬体和氧自由基(ROS)水平,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬体数量变化.结果 1)慢病毒为shRNAD J-1载体感染心肌HL-1细胞后DJ-1表达水平下调；2)缺氧复氧显著上调ROS,而shDJ-1加剧缺氧复氧ROS水平上调,NAC可以有效下调细胞内ROS水平；3)Western blot检测LC3、Beclin-1自噬标志蛋白和MDC染色细胞内自噬体结果均认为缺氧复氧促进自噬,而shDJ-1加剧缺氧复氧导致的自噬上调,NAC抑制自噬上调；4)流式细胞术检测显示shDJ-1增加缺氧复氧凋亡,NAC可以减少心肌细胞凋亡.结论 DJ-1拮抗ROS介导Beclin-1上调参与保护缺血再灌注心肌.
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DJ-1基因与帕金森病
遗传因素在帕金森病发病中的作用越来越受到人们的关注.DJ-1基因是新近发现的又一个帕金森病的致病基因.本文就DJ-1的组织分布及其病理特点,DJ-1的结构与功能,DJ-1的病理性突变及在散发和早发帕金森病中的突变频率,DJ-1的致病机制进行了概述.
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DJ-1、PTEN的表达与良性脑膜瘤复发和演进的关系
目的 探讨DJ-1蛋白和PTEN蛋白在各类型脑膜瘤的表达及其与良性脑膜瘤的复发和演进的关系.方法 选取广东同江医院2010-2014年手术切除脑膜瘤病例72例,其中良性(WHO Ⅰ级)术后无复发的脑膜瘤50例,术后复发良性脑膜瘤12例,高级别脑膜瘤(WHOⅡ～Ⅲ级)10例.采用免疫组化检测DJ-1及PTEN在脑膜瘤组织中的表达.结果 DJ-1及PTEN在术后无复发的、术后复发的良性脑膜瘤及高级别的脑膜瘤表达不同,差异有统计学意义(P＜0.05);DJ-1、PTEN的表达强度与良性脑膜瘤的复发和演进呈正相关.结论 DJ-1、PTEN的表达与良性脑膜瘤的复发和演进相关.
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DJ-1在胰腺癌中的表达及临床意义
目的 探讨DJ-1在胰腺癌中的表达及与患者预后的关系.方法 选取64例胰腺癌患者作为胰腺癌组,选取门诊健康体检者作为对照组,胰腺癌组根据DJ-1的表达水平进行亚分组(高DJ-1组和低DJ-1组).采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组的血清DJ-1和CA19-9水平,统计不同TNM分期的胰腺癌患者的血清DJ-1和CA19-9水平,分析DJ-1与CA19-9水平的相关性及DJ-1水平与患者生存率的关系.结果 胰腺癌组患者的血清DJ-1水平高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05).随着TNM分期的增加,胰腺癌患者的血清DJ-1和CA19-9水平随之升高(P﹤0.05).胰腺癌患者血清DJ-1与CA19-9水平呈显著正相关(P﹤0.01).高DJ-1组较低DJ-1组存在较高比例的肝脏及淋巴结转移,且肿瘤大小及TNM分期较低DJ-1组高(P﹤0.05).术后14周后,高DJ-1组的生存率迅速降低,两组患者的生存率比较,差异有统计学意义(P﹤0.05).结论 DJ-1在胰腺癌患者的血清中高表达,DJ-1高表达的胰腺癌患者TNM分期较高,生存率较低,提示DJ-1水平可能为胰腺癌患者预后的生物标志物之一.
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三阴性乳腺癌组织DJ-1和PTEN及AR表达与预后相关性分析
目的:探讨三阴性乳腺癌(TNBC)组织中帕金森相关蛋白(DJ-1)、第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)和雄激素受体(AR)的表达及其与临床病理因素和预后的关系.方法:免疫组织化学SP法检测DJ-1、PTEN和AR蛋白在68例TNBC组织和30例正常乳腺组织中的表达,并分析其与TNBC临床病理因素的关系,及其对预后的影响.结果:TNBC组织中DJ-1阳性表达率为70.6％(48/68),AR阳性表达率为36.8％(25/68).正常乳腺组织中DJ-1阳性表达率为6.7％(2/30),无AR表达.TNBC组织中DJ-1、AR阳性表达率明显高于正常乳腺组织,x2值分别为7.09和6.72,P值分别为0.002和0.005.TNBC组织中PTEN阳性表达率为27.9％(19/68),正常乳腺组织中为100.0％.TNBC组织中PTEN阳性表达率显著低于正常乳腺组织,x2=5.94,P=0.008.DJ-1、PTEN和AR表达在TNBC组织中的表达与腋窝淋巴结转移、组织学分化和TNM分期密切相关,P＜0.01.TNBC组织中DJ-1和AR的表达均与PTEN蛋白的表达呈负相关,r=-0.529,P=0.009;而两者之间呈正相关,r=0.496,P=0.011.在5年无瘤生存率和5年总生存率方面,DJ-1和AR表达阴性者明显高于阳性者,P＜0.01;PTEN表达阳性者高于阴性者,P＜0.01.Cox回归多因素分析结果表明,腋窝淋巴结转移、DJ-1、PTEN及AR表达是影响TNBC患者5年无瘤生存率的独立预后因素,P＜0.05.结论:TNBC组织中DJ-1和AR过表达,而PTEN表达下调,三者均为TNBC患者预后的独立危险因素,参与调控TNBC的发生与预后.
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散发性乳腺癌中DJ-1蛋白高表达与不良预后
目的 探讨DJ-1蛋白表达水平在散发性乳腺癌发生、发展及预后中的临床意义.方法 采用免疫组织化学法检测了包含199例散发性乳腺癌组织与160例乳腺良性增生组织的组织微阵列芯片中DJ-1蛋白的表达情况,同时应用酶联免疫吸附试验检测48例散发性乳腺癌及35例乳腺良性增生患者血清中DJ-1蛋白的水平,并分析组织中DJ-1蛋白表达水平与乳腺癌患者临床病理指标及生存资料的相关性.统计分析采用Pearson x2检验和独立样本t检验;生存分析采用log-rank检验绘制Kaplan-Meier曲线,Cox回归用于进行多变量分析.结果 DJ-1蛋白在乳腺良性增生组织及乳腺癌组织中阳性表达率分别为33.8％ (54/160)、48.7％(97/199),在乳腺良性增生及乳腺癌患者血清中DJ-1蛋白平均水平分别为(25.86±7.28) ng/ml和(31.31±8.39) ng/ml,与乳腺良性增生相比,乳腺癌组织(x2=8.182,P=0.004)及血清(t=3.161,P=0.002)中DJ-1蛋白的表达水平均显著增加;淋巴结转移阳性的乳腺癌组织与阴性组织相比,DJ-1表达水平显著增加(x2=5.372,P=0.020);随着组织学分级的增加,浸润性导管癌中DJ-1表达水平显著增高(x2=5.244,P=0.022);DJ-1阳性表达与患者生存期缩短显著相关(OS:x2=5.427,P=0.020;x2=4.606,DFS:P=0.032).单变量Cox回归分析发现,DJ-1表达水平作为危险因素与患者的OS及DFS显著相关(OS:P=0.023; DFS:P=0.036),但多变量Cox回归分析发现,DJ-1表达水平并非影响患者预后的独立风险因素(OS:P=0.561; DFS:P=0.342).结论 在散发性乳腺癌中,DJ-1蛋白表达水平显著增高,其高表达与乳腺癌的侵袭转移、病程进展及不良预后相关.
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DJ-1、张力蛋白同源10q丢失的磷酸酶基因和黏着斑激酶在口腔癌及癌前病变中的表达
目的 探讨在口腔鳞状细胞癌及癌前病变中DJ-1、张力蛋白同源10q丢失的磷酸酶基因(phophatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的作用,以期为口腔癌的早期防治及基因靶向治疗提供依据.方法 收集广东省口腔医院黏膜牙周科2005年1月至2010年12月的病理标本,包括口腔鳞状细胞癌44例(口腔鳞状细胞癌组)、单纯增生20例(单纯增生组)、异常增生15例(异常增生组)和健康对照标本10例(健康对照组).采用免疫组化方法检测D J-1、PTEN及FAK 3种蛋白的表达.结果 免疫组化结果显示DJ-1在健康对照组、单纯增生组、异常增生组及口腔鳞状细胞癌组中的表达分别为3/10、50％ (10/20)、10/15和91％ (40/44),口腔鳞状细胞癌组织中DJ-1的表达显著增高,与其他组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；PTEN在健康对照、单纯增生组的阳性表达均为100％,在异常增生及口腔鳞状细胞癌组中的表达分别为13/15与45％(20/44),而FAK在健康对照、单纯增生、异常增生及口腔鳞状细胞癌组中的表达分别为10/10、95％ (19/20)、14/15和80％(35/44),表明PTEN和FAK在OSCC组织中的表达降低,与其他组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)；相关性分析表明D J-1与PTEN之间呈负相关关系(r=-0.75,P＜0.05),PTEN和FAK间呈正相关关系(r=0.28,P＜0.05).结论 D J-1、PTEN、FAK在口腔鳞状细胞癌的发生过程中可能起重要作用.
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DJ-1介导缺氧心肌HL-1细胞线粒体动力学变化
目的 探讨DJ-1参与缺氧心肌细胞线粒体动力学改变的机制.方法 采用慢病毒载体shRNA DJ-1感染心肌HL-1细胞株,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜、线粒体-细胞质亚结构分离技术和Western blot观察缺氧后线粒体融合-分裂蛋白DRP1、MFN1和MFN2蛋白表达、线粒体膜电位及线粒体形态变化.结果 正常和缺氧培养时,稳定表达shRNA DJ-1的HL-1细胞DJ-1蛋白表达均显著下调,而在缺氧培养时shRNA DJ-1细胞的线粒体标志蛋白TOM20蛋白表达显著下调.流式细胞仪结果表明,空慢病毒对照缺氧组相比正常空慢病毒对照组线粒体膜电位下调,而shRNA DJ-1加剧这种线粒体膜电位下调.分离缺氧培养心肌HL-1细胞线粒体,线粒体分裂蛋白DRP1和融合蛋白MFN2表达均增加.结论 缺氧条件下DJ-1是线粒体动力学平衡稳定的因素.
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DJ-1蛋白与糖尿病的关系研究进展
DJ-1蛋白是1997年Nagakubo应用双酵母杂交系统时发现的一种表达于全身各组织的蛋白.既往研究已证实,DJ-1在帕金森病的发生发展过程中起着重要作用.近年来发现,DJ-1可通过抗氧化及调节凋亡等途径抑制胰岛β细胞过度凋亡、促进胰岛素释放及保持血糖稳态,终参与糖尿病的发生和发展,因此本文就DJ-1与糖尿病之间的研究进展进行综述.
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中国弱精症患者精液氧化损伤评价
目的:探讨弱精症发病的分子机制.方法:收集113例弱精症患者和58例年龄相仿的健康志愿者正常精液样本,分离精子、精浆,分别检测其氧化损伤状态.结果:弱精症患者组的精浆样本中,总抗氧化能力(T-AOC),铜锌-超氧化物歧化酶(SOD-1),总超氧化物歧化酶(T-SOD),还原型谷胱甘肽(GSH)的结果均低于正常组,但是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力显著性高于正常组；精子裂解液测定结果显示,弱精症患者的SOD-1和T-SOD的活力显著性低于正常组,而GST活力两组基本相当.结论:弱精症患者精液中存在的由于DJ-1低表达而引起的氧化应激损伤,是其可能的发病分子机制之一.
关键词： 弱精症 氧化损伤 DJ-1 铜锌-超氧化物歧化酶 还原型谷胱甘肽 -
DJ-1蛋白的原核表达纯化及在中药评价中的应用
目的:建立DJ-1蛋白原核表达及纯化的技术体系,通过SPR技术评价中药化合物.方法:采用大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细菌,通过热休克法和IPTG诱导,对GST标记的WT DJ-1蛋白进行原核表达,对GST标签进行切割,采用亲和层析法进行纯化,并通过SPR技术,对7个中药多酚类单体化合物进行WT DJ-1蛋白结合筛选.结果:原核表达并纯化得到高纯度的WT DJ-1蛋白,通过SPR技术筛选出1个与WT DJ-1蛋白有结合的化合物3-O-去甲紫药双口山酮苷(3-O-demethylswertipunicoside,3-ODS).结论:成功建立了DJ-1蛋白原核表达及纯化的技术体系,可用于评价与DJ-1蛋白结合的化合物.
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线粒体功能障碍与帕金森病关系的研究进展
帕金森病是一种多因素引发的神经退行性疾病,表现为黑质纹状体致密部多巴胺能神经元退行性病变.越来越多的研究表明,线粒体功能障碍在帕金森病形成过程中起重要作用.线粒体蛋白parkin,PTEN诱导的激酶1和DJ-1通路的变化以及o突触核蛋白的过表达均是引起线粒体功能障碍的主要原因.目前,研究人员正在努力寻找能够改善线粒体功能从而治疗帕金森病的药物,有些药物已进入临床试验阶段.
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内源性抗氧化蛋白DJ-1:弱精症治疗的潜在靶点
弱精症是一种常见的男性不育疾病,表现为精子前向运动能力的减退,其病因尚不明确.D J-1蛋白广泛存在于肝脏、骨骼肌、肾脏、大脑和睾丸,与包括男性不育症在内的许多疾病相关.本文旨在说明DJ-1对精子的内源性抗氧化作用与弱精症有关,D J-1的抗氧化作用可能成为弱精症治疗的潜在靶点.
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自噬参与DJ-1保护大鼠黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮损伤
目的 观察过表达DJ-1是否缓解鱼藤酮致SD大鼠中脑黑质多巴胺能神经元损伤及其机制.方法 在大鼠黑质致密部注射携带DJ-1、LacZ或者GFP-DJ-1、GFP的腺相关病毒颗粒,4周后注射鱼藤酮.通过免疫组织化学方法鉴定基因表达情况,并检测 TH阳性神经元数量,验证DJ-1保护作用.通过Western blotting方法检测自噬相关蛋白表达水平.结果 鱼藤酮损伤4周时,可见过表达DJ-1组大鼠损伤侧黑质的TH阳性神经元数目显著高于单纯鱼藤酮损伤组,差异有统计学意义(P<0.05).蛋白印迹检测动物损伤侧黑质自噬相关蛋白Beclin1、p-mTOR的表达和LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值,发现DJ-1过表达组中Beclin1与LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值均较对照组增加,差异有统计学意义;而p-mTOR的表达较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 DJ-1能抵抗鱼藤酮对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤,DJ-1能上调自噬水平.
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帕金森病基因PINK1和J-1的转录水平在神经毒损伤的MN9D细胞中的不同变化
目的 在细胞水平上探究神经毒素作用下,关键的帕金森(Parkinson's disease)致病基因PINK1和DJ-1的转录情况,并从表观遗传学角度对其机制进行初步探索.方法 本研究使用MN9D细胞系作为研究对象.通过台盼蓝活细胞计数的方法筛选神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和1-甲基-4-苯基嘧啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)的半数致死剂量.通过半定量RT-PCR方法检测DJ-1基因和PINK1基因转录情况.通过RT-PCR以及免疫细胞荧光染色方法检测DNA去甲基化酶TET1的转录表达情况.结果 1)MN9D活细胞数在6-OHDA和MPP+作用下均发生了时间、剂量依赖性降低,6-OHDA和MPP+的半数致死剂量分别约为10 μmol/L和100 μmol/L.2)J-1的mRNA水平在6-OHDA或MPP+作用下未发生改变,而PINK1的mRNA水平则发生了明显的时间依赖下降.3)DNA去甲基化酶TET1的转录表达水平也发生显著下降.结论 神经毒素作用下,帕金森病致病基因PINK1的转录发生下调,并可能是由DNA去甲基化酶TET1表达下调所介导的.
关键词： 帕金森病 神经毒性 PINK1 DJ-1 DNA去甲基化酶TET1 -
DJ-1,α-Synuclein基因对帕金森病氧化应激作用的机制
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,尽管其确切的发病机制还不清楚,但是许多证据提示,氧化应激可能在其发病过程中起重要的作用.
关键词： DJ-1 α-synuclein 帕金森病 氧化应激 -
DJ-1与子痫前期关系的研究进展
DJ-1又名帕金森病蛋白7(Parkinson disease protein 7,PARK7)属于ThiJ/PfpI/DJ-1超家族,DJ-1是一种抗氧化剂,抗氧化应激是其主要功能,近年研究发现DJ-1在子痫前期(preeclampsia,PE)患者胎盘组织中表达水平升高,推测DJ-1通过氧化应激途径参与子痫前期的发生发展.子痫前期是妊娠期特有疾病,是导致孕产妇和新生儿发病率和死亡率增高的主要原因.但子痫前期的病因和发病机制尚在研究探讨,其中氧化应激损伤参与子痫前期的发生发展是其中研究的一个热点,就DJ-1在子痫前期中的作用机制进行综述.
