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线粒体自噬与心肌保护
线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。通过该途径，细胞可降解并清除受损或功能障碍的线粒体，以维持细胞内线粒体质量和数量的平衡，从而维持细胞稳态。在生理状态及应激状态下，多种因子可调控心肌细胞线粒体自噬，进而发挥保护心肌细胞的作用。本文就线粒体自噬及其调控机制以及其在心肌保护中的作用做一综述。
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华支睾吸虫parkin蛋白的分子生物学特征研究
目的 了解华支睾吸虫Parkin蛋白(Clonorchis sinensis Parkin)的生物学特性. 方法 从华支睾吸虫cD-NA文库获得Parkin的cDNA全长,NCBI搜索与之相似度高的基因序列,预测其所含结构域和功能;应用MEGA5程序对来自GenBank中与之有较高相似度的基因序列进行分析,构建基因进化树;原核表达重组融合蛋白CsParkin,纯化后免疫Blab/c小鼠,获得多克隆抗体,采用Western blot鉴定天然CsParkin;采用qRT-PCR测定CsParkin基因在不同发育阶段的表达水平. 结果 CsParkin蛋白含有5个结构域,分别是Ubl、RING0、RING1、IBR和RING2,具有典型的Parkin蛋白结构;该蛋白与人及各种动物的Parkin有很高的相似度,与其他吸虫有更近的进化关系;Western blot显示原核表达的重组CsParkin,与天然CsParkin分子质量相同,均为45.7 ku;CsParkin在囊蚴中的表达量高于成虫;免疫组化显示CsParkin主要分布于成虫受精囊中的精子及口吸盘和睾丸,在囊蚴中广泛分布. 结论 肝吸虫CsParkin属蛋白于保守蛋白,具有典型的泛素连接酶3的功能结构,推测其在蛋白的泛素化中起到作用,可能在华支睾吸虫的生长过程中发挥作用.
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Parkin基因在肝细胞癌中的表达与临床意义
目的 探讨Parkin基因mRNA及其蛋白在肝细胞癌中的表达规律及其临床意义.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学(S-P)法检测58例肝细胞癌中Parkin基因mRNA及蛋白的表达情况,结合病人的临床病理资料分析Parkin基因在肝细胞癌中的意义.结果 肝癌组织中Parkin基因mRNA及蛋白的表达明显降低,阳性率分别为22.4%(13/58)和25.9%(15/58),明显低于癌旁肝组织的表达阳性率:94.8%(55/58)和89.7%(52/58),其差异有统计学意义(P＜0.05),且Parkin基因蛋白表达的缺失与病人的性别、肿瘤的大小、甲胎蛋白(AFP)、HBsAg、以及有无肝硬化无关(P＞0.05),而与肿瘤的分化程度、有无包膜及有无门静脉癌栓有关(P＜0.05).结论 Parkin基因在肝细胞癌的发生过程中可能起重要的作用,其表达水平可能成为肝细胞癌诊断及判断其生物学特性的重要分子生物学指标.
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家族性帕金森病的基因研究进展(综述)
回顾了近年来家族性帕金森病(Parkinson disease ,PD)的基因研究新进展.第4号染色体长臂上的α-synuclein基因在第4号外显子上的1 个错义点突变(G209A),导致其编码的氨基酸序列上的53位氨基酸由丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr,A53T),从而发生聚集、缠绕和纤维化,致使多巴胺神经元死亡.青年型PD综合征与第6号染色体长臂6q25.2-27之间的一个称为Parkin的基因密切相关,其第3～7号外显子的不规则缺失突变,导致Parkin丧失运输有缺陷的或已失活蛋白的能力,还有可能导致其丧失细胞生长、分化和发育的调控功能,终表现为多巴胺神经元死亡和缺失;对位于第2号染色体短臂上的Park3基因的研究,虽然其具体机制不清楚,但可能为散发性PD的研究提供一些启示.
关键词： 帕金森病 α-synuclein Parkin Park3 家族 性 -
Parkin 相关的青少年型帕金森病一例
1病例报告患者女，19岁，大二学生。因“左下肢无力，行动慢5年”就诊于作者医院门诊。2008年冬出现左下肢无力，不爱活动，症状轻微，未在意。1年后左下肢行走不灵活，有时拖步，2年后左手变笨拙，写字速度慢，刷牙洗脸等精细活动不受影响。近1年来，肢体无力加重，行走笨拙，左上肢姿势性震颤，偶尔摔跤，起步困难，日常生活和学习不受影响，无饮水呛咳、吞咽困难，无幻觉和性格改变。便秘5年，睡眠多梦。2013‐08就诊于作者医院门诊，查体：意识清楚，表情稍少，言语正常，高级智能正常，脑神经检查未见异常，起立慢，行动慢，左脚拖步走，四肢肌力可，肌张力增高，左下肢肌张力异常明显，腱反射对称活跃，病理征（－），共济运动无异常。既往史、个人史无特殊。爷爷、姑奶、父亲有良性震颤，1弟1妹正常。外院血液化验未发现异常，脑电图、头颈胸腰 MRI 未见异常。给予美多巴62.5 mg 口服，1 h 后四肢肌张力明显减轻，行动轻松，临床考虑青少年型帕金森病（juvenile Parkinson disease ，PD‐j）可能性大。行基因检测：取患者外周静脉抗凝血5 mL ，提取DNA 进行 PARK2（常染色体隐性遗传性 PD‐j 常见基因）和 SLC6A3（常染色体隐性遗传的婴幼儿肌张力障碍‐帕金森病基因）基因检测。采用 PCR 扩增和琼脂糖电泳检测法，对 PARK2基因12对外显子进行基因检测，针对 Exon4设计的第一对上游引物4F （ GCAAATGTTCCT‐GAAGACTG ）、下游引物4R （ GAAAGAAATC‐CAGAAGACAAAG）扩增失败（图1），根据文献推测［1］是从 Exon4上游到 Exon4下游的大片段缺失，设计了第二对上游引物4Fb（CCCGAACATTTACTTACATATTAC）、下游引物4Rb（TCAGATTAGACAGTCCAGGTTC），仍然扩增失败（图2）。引物均经过验证。综上推测可能的情况是从 Intron3到 Intron4（包含 Exon4）区间的大片段缺失，具体的缺失位置未验证。 SLC6A3未见异常。
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线粒体功能障碍与帕金森病关系的研究进展
帕金森病是一种多因素引发的神经退行性疾病,表现为黑质纹状体致密部多巴胺能神经元退行性病变.越来越多的研究表明,线粒体功能障碍在帕金森病形成过程中起重要作用.线粒体蛋白parkin,PTEN诱导的激酶1和DJ-1通路的变化以及o突触核蛋白的过表达均是引起线粒体功能障碍的主要原因.目前,研究人员正在努力寻找能够改善线粒体功能从而治疗帕金森病的药物,有些药物已进入临床试验阶段.
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Parkin蛋白在鼻咽癌中表达及临床意义
目的 研究Parkin蛋白在鼻咽癌中表达及临床意义.方法 运用Elivision TM S-P免疫组化技术的方法检测54例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽上皮组织Parkin蛋白表达水平,分析Parkin蛋白表达与鼻咽癌患者临床病理特征关系.结果 54例鼻咽癌组织Parkin蛋白表达水平为“-”23例,“+”12例,“++”7例,“+++”12例,16例正常鼻咽上皮组织Parkin蛋白表达水平为“-”0例,“+”0例,“++”3例,“+++”13例,鼻咽癌组织Parkin蛋白表达明显降低(P＜0.05),Parkin蛋白表达与患者年龄、性别、T分期、TNM分期、病理类型无明显关系(P＞0.05),而与淋巴结转移有关(P＜0.05).结论 Parkin基因在鼻咽癌的发生发展中起抑癌基因作用,Parkin蛋白表达可作为判断鼻咽癌临床预后预测指标.
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线粒体自噬在心肌细胞中的作用
线粒体是真核生物细胞进行氧化磷酸化生成能量的场所.2004年Kissovd等[1]在对酵母的研究中首次发现选择性降解线粒体的现象.Lemasters[2]在2005年首次提出“线粒体自噬”,主要是指在活性氧(reactive oxygen species,ROS)、营养缺乏、细胞衰老等刺激下,细胞内的线粒体发生去极化损伤,损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中,并与溶酶体融合,从而完成损伤线粒体的降解.线粒体自噬对于维持心肌细胞正常的代谢和功能十分重要,对病理情况下线粒体自噬所扮演的角色还存在争议.
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帕金森病研究中iPSCs疾病模型的选择和应用
帕金森病是一类以黑质多巴胺能神经元的进行性变性为特点的运动性疾病,在以往对帕金森病的研究中,由于缺乏对患者特异性的多巴胺能神经元的认识,阻碍了人们对疾病机制的认识和药物的研发.诱导性多潜能干细胞的出现弥补了这一缺陷,将人们对帕金森患者黑质多巴胺能神经元易损性和疾病的治疗研究推进到一个更崭新的发展阶段.
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帕金森病致病基因Parkin的研究进展
帕金森病在全球神经退行性疾病中的发病率中,仅次于阿尔茨海默病.Parkin是帕金森病的相关致病基因之一,自日本学者发现并证实其与帕金森病发病相关以来,关于Parkin的研究迅速发展.Parkin的基本结构和生理功能、蛋白底物、相关基因以及其致病机制已被众多文献报道,该文综述了Parkin及蛋白的结构,并对Parkin的泛素-蛋白体酶系统详细介绍,指出了Parkin的相关反应物以及和线粒体的关系,并对其发展前景提出设想.
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百草枯中毒对大鼠肺线粒体自噬的影响
目的:建立百草枯(paraquat,PQ)中毒大鼠模型,观察不同阶段肺线粒体膜电位(JC-1)、调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin,肺线粒体自噬透射电镜病理等改变,探讨百草枯中毒对大鼠肺线粒体自噬的影响.方法:成年雄性SD大鼠42只,随机分为正常对照组(n=6)、模型组(n=36),模型组下设2h、12 h、1d、3d、7d和14 d共6个时间点,每个时间点各6只大鼠.使用20％ PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃大鼠建立PQ中毒模型.HE染色和Masson染色观察PQ中毒后肺组织纤维化病变;JC-1染色检测肺组织线粒体膜电位变化;Western blot检测PINK1、Parkin蛋白变化、透射电镜观察肺线粒体自噬病理改变.结果:与对照组相比,随着PQ中毒时间的延长,肺纤维化病理评分较对照组升高,差异有统计学意义(P＜0.05);PQ中毒大鼠肺组织JC-1红绿荧光比均较对照组降低,Westem blot提示随中毒时间延长,PINK1及Parkin蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).透射电镜进一步证实PQ中毒大鼠肺线粒体出现明显自噬改变.结论:本研究通过检测肺线粒体JC-1、调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin及肺线粒体电镜病理等证实了PQ中毒诱发了大鼠肺线粒体自噬,线粒体自噬可能参与了PQ大鼠肺纤维化的发生发展.
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脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin 表达及线粒体自噬形成
目的：探讨巨噬细胞在脂多糖（ LPS）处理后parkin表达及对线粒体自噬的影响。方法：无菌分离并原代培养小鼠腹腔巨噬细胞；200 ng/ml LPS作用巨噬细胞，JC-1标记线粒体，流式细胞仪检测线粒体膜电位变化；RT-PCR 检测巨噬细胞parkin mRNA水平；Western blot 检测parkin及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平；激光共聚焦显微镜分别检测巨噬细胞在LPS处理前后parkin在细胞内的分布及与LC3和线粒体三者的共定位情况。结果：JC-1染色流式细胞仪检测结果显示，LPS处理后，巨噬细胞线粒体膜电位降低，并随LPS作用时间延长呈持续下降趋势；parkin mRNA在LPS处理6 h内仅有少量的增加，但parkin蛋白水平在LPS刺激6 h后增加明显；parkin在巨噬细胞定位结果表明，未受LPS处理时parkin呈弥散均匀分布，而LPS刺激后parkin呈明显的点状聚集；Western blot检测结果显示巨噬细胞在LPS刺激后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增大，表明巨噬细胞发生明显的自噬；激光共聚焦显微镜结果显示，巨噬细胞在LPS 刺激后，parkin、LC3和线粒体三者存在共定位关系。结论：巨噬细胞在LPS刺激后，parkin表达增加并介导线粒体自噬形成，参与对损伤线粒体的清除，可能在巨噬细胞参与的炎症反应中发挥一定的调控作用。
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PINK1／parkin，线粒体自噬与帕金森病
帕金森病（ PD）是常见的运动失调性疾病和第二常见的神经变性疾病，位列阿尔茨海默病之后。年龄的增长是散发性PD发病的重要影响因素。许多基因的突变相关于家族性PD，这些基因包括 SNCA〔1〕、parkin〔2〕、 UCHL1〔3〕、PINK1〔4〕、DJ-1〔5〕、LRRK2〔6，7〕、 ATP13A2〔8〕、 GIGYF2〔9〕、Omi／HTRA2〔10〕、PLA2G6〔11〕和FBXO7〔12〕。在病理上，PD以投射到纹状体的黑质致密部（ SNc）的多巴胺能神经元选择性丢失为特征。黑质纹状体的退行性改变和纹状体多巴胺能递质的耗竭是PD患者包括运动迟缓、运动功能减退、僵化、静止性震颤和姿势不稳定等运动症状的主要原因。然而，神经变性的进程是不会局限于多巴胺神经元的，也能影响去甲肾上腺素（蓝斑）、羟色胺（中缝背核）、胆碱（ Meynert的下橄榄核）系统、大脑皮层、脑干、脊髓和周围神经系统〔13～15〕，这也能够解释PD的非运动方面的临床表现，例如自主神经功能紊乱、睡眠障碍、抑郁和认知障碍。 PD的另一种明显的病理表现是包含有聚集的a-synucle-in〔16〕在内的许多蛋白在神经细胞核周的堆积。许多来自于不同的动物等模型的证据表明，低聚的中间体而不是终的蛋白聚集体是影响着神经系统的毒性过程〔17，18〕。然而，致病作用和Lewy体的意义仍不清楚〔19，20〕。一方面，Lewy体可能是通过隔离毒性的没有折叠a-synuclein而被赋予保护神经作用；另一方面，他们也许作为储存器和毒性蛋白的源头，这是由于蛋白质的包含物是动态改变的〔21，22〕，终，这些储存的蛋白聚集体通过蛋白酶体通路和自噬-溶酶体通路得以降解。 Lewy体不是出现在所有的PD而是出现在许多家族史患者；然而，在MPTP诱导的人类PD中没有报道，可能 PD可能没有统一的疾病实体〔23，24〕。散发性PD的发病机制，主要来自于PD，可能与基因易感性的可变性以及环境因素有关。近年来越来越多的证据表明，线粒体自噬功能障碍在PD的发病机制中扮演者重要的角色。
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蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元变性伴包涵体形成
目的观察蛋白酶体抑制剂诱导黑质多巴胺(DA)能神经元变性伴胞浆内包涵体形成, 探讨蛋白酶体功能在帕金森病发病机制中的作用.方法将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射至大鼠黑质部位.免疫荧光观察黑质区DA神经元变性缺失及胶质细胞变化.免疫荧光双标法观察DA能神经元内蛋白聚集的包涵体及其主要成分α-共核蛋白(α-synuclein)、Parkin 和泛素(ubiquitin)的表达.同时观察DA能神经元发生细胞凋亡.结果注射Lactacystin第7天大鼠开始出现自发性活动减少,阿扑吗啡可诱导出旋转行为;3周后黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞减少,呈剂量依赖性;小胶质细胞增生明显.TH与硫磺素、硫磺素与α-synuclein、硫磺素与Parkin、以及硫磺素与ubiquitin复合染色呈阳性;TH与 TUNEL双染亦呈阳性.结论 Lactacystin对多巴胺能神经元具有毒性作用,且导致蛋白聚集,包涵体形成.蛋白酶体功能异常可能在帕金森发病机制中起重要作用.
关键词： lactacystin 帕金森病 α-共核蛋白 Parkin 泛素 -
线粒体自噬新研究进展
活性氧由线粒体产生且作用于线粒体.在压力环境下,选择性降解损伤的线粒体,并维持正常的线粒体数量对维持细胞的正常结构、生长起重要作用.线粒体通透性改变、过氧化氢酶失活等诸多影响因素都会促进线粒体自噬的发生.近研究发现PINK1-Parkin信号通路,Mfn1、Mfn2和OPA1等蛋白与线粒体关系紧密,调控线粒体的融合、分裂、自噬.线粒体自噬可能导致神经退行性疾病,主要的神经退行性疾病包括帕金森病(Parkinson's disease,PD)、肌萎缩侧索硬化症(Alzheimer's disease,AD)、亨廷顿舞蹈病等(Huntington's disease,HD),这些与线粒体的动态改变有关.
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Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建
目的:构建Parkin基因过表达质粒并转染SH-SY5Y细胞,为进一步研究帕金森病的发病机制及中药的作用环节奠定基础.方法:首先构建Parkin基因过表达质粒,采用脂质体转导技术,将Parkin过表达质粒应用Lipo3000转染SH-SY5Y细胞.荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR检测其ParkinmRNA的表达;Western Blot技术检测其Parkin蛋白的表达.结果:转染组可观测到较多的绿色荧光蛋白表达;Parkin过表达细胞ParkinmRNA和蛋白的表达均显著提高(P＜0.01).结论:通过脂质体转导技术,应用Lipo3000可将Parkin过表达质粒成功转染入SH-SY5Y细胞,转染的基因和蛋白表达均较高,提示此法可成功构建Parkin基因过表达的细胞模型.
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PIN K1/parkin通路调控线粒体自噬机制的研究进展
线粒体自噬指细胞通过自噬机制选择性除去损伤或多余的线粒体.真核生物通过线粒体自噬调控线粒体质量,维持供能细胞器的功能.大量研究表明,帕金森病相关基因PINK1和parkin可通过线粒体自噬参与并维持线粒体功能.PINK1与parkin能协同特异性识别损伤的线粒体,PINK1作为线粒体质量调控的探测器被活化,此过程中泛素化酶和去泛素化酶对维持parkin活性及线粒体自噬的效率有重要作用.本文主要总结PINK1/parkin通路在线粒体自噬中的功能与作用.
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肝细胞癌中Parkin与PTEN蛋白的表达及意义
目的 探讨Parkin基因蛋白和与张力蛋白同源、第10染色体丢失的磷酸酶(PTEN)基因蛋白在肝细胞癌中的表达规律及其临床意义.方法 应用免疫组织化学(S-P)法检测58例肝细胞癌中Parkin和PTEN基因蛋白的表达情况,结合患者的临床病理资料分析Parkin基因与PTEN基因在肝细胞癌中的作用及其相关性.结果 在58例肝癌组织中,Parkin和PTEN蛋白阳性表达率分别为25.9%(15/58)和36.2%(21/58),明显低于在相应的癌旁组织及正常肝组织中的表达率,其差异均有统计学意义(P＜0.05).Parkin基因蛋白表达的缺失与患者的性别、肿瘤的大小、甲胎蛋白(AFP)、HBsAg以及有无肝硬化无关(P＞0.05),而与肿瘤的分化程度、有无包膜及有无门静脉癌栓有关(P＜0.05);PTEN基因蛋白表达的缺失则与甲胎蛋白(AFP)、肿瘤的分化程度有关(P＜0.05).结论 Parkin和PTEN基因在肝细胞癌的发生过程中可能起重要的作用,其表达水平可能成为肝细胞癌诊断及判断其生物学特性的重要分子生物学指标.
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VEGF、EGFR 及 Parkin蛋白在鼻咽癌中的表达及三者间的相关性研究
目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）及Parkin蛋白在鼻咽癌（NPC）中的表达情况以及三者间的相关性。方法应用免疫组化SP法检测48例NPC组织和34例正常鼻咽部上皮组织中VEGF、EGFR及Parkin蛋白的表达，并探讨三者间的相关性。结果 NPC组织中VEGF和EGFR蛋白表达阳性率明显高于正常鼻咽部上皮组织，Parkin蛋白表达阳性率则明显下降，且均有统计学差异（均P＜0.05）。NPC组织中VEGF蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移及临床TNM分期密切相关（均P＜0.05），而与患者的年龄、性别、病理类型、T分期均无关（均P＞0.05）；EGFR和Parkin蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移密切相关（均P＜0.05），而与患者的年龄、性别、病理类型、T分期、临床TNM分期均无关（均P＞0.05）。NPC组织中VEGF和EGFR蛋白的表达呈正相关（P＜0.05），Parkin和VEGF、EGFR蛋白的表达无相关性（均P＞0.05）。结论 VEGF、EGFR及Parkin蛋白与NPC发生、发展有关，VEGF、EGFR及Parkin蛋白表达可作为NPC的预后判断指标，NPC中VEGF和EGFR可能起协同作用，而Parkin则可能单独发挥作用。
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Parkin基因甲基化对鼻咽癌早期诊断及预后判断的价值研究
目的：研究Parkin基因甲基化在鼻咽癌早期诊断及预后判断中的价值。方法运用甲基化特异性PCR检测54例鼻咽癌组织、16例慢性鼻咽炎症组织和16例正常鼻咽上皮组织中Parkin基因启动子区甲基化情况，并分析其与鼻咽癌临床生物学因素的关系。结果慢性鼻咽炎症组织和正常鼻咽上皮组织中均未检测到Parkin基因甲基化，而在鼻咽癌组织中甲基化率为62.96%(34/54)，3种鼻咽组织Parkin基因甲基化情况比较有统计学差异（P＜0.05）。进一步统计学分析发现鼻咽癌组织Parkin基因甲基化与其临床生物学因素均无关（均P＞0.05）。结论 Parkin基因甲基化具有肿瘤特异性，与鼻咽癌发生、发展密切相关，有望成为早期分子生物学辅助诊断的标志物，但不能作为判断鼻咽癌预后的预测指标。
