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Mfn2在正常组织与肿瘤组织中的表达差异研究
目的 比较线粒体融合蛋白-2(Mfn2)在乳腺癌、甲状腺癌和大肠癌组织及相应正常组织中的表达差异,探讨Mfn2与肿瘤发生的关系.方法 选取经病理检查确诊的乳腺癌、甲状腺癌和大肠癌标本各20例,另取相应癌旁正常组织作为对照,采用免疫组织化学染色SABC法对Mfn2在不同组织中的表达水平进行测定和对比分析.结果 免疫组化染色显示,在乳腺癌、甲状腺癌、大肠癌组织中表达水平均明显低于相应正常组织(P<0.01).结论 Mfn2在乳腺癌、甲状腺癌和大肠癌组织中表达低于正常组织,Mfn2与这3种恶性肿瘤的发生、发展密切相关,可作为预测三种恶性肿瘤转移及其预后的参考指标.
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膀胱癌组织MFN2、Bmi-1蛋白表达及临床意义分析
目的 探讨膀胱癌组织中线粒体融合蛋白2(MFN2)、Bmi-1蛋白表达情况及临床意义.方法 选取膀胱癌组织标本80例,同时另选取正常膀胱组织标本80例作为对照.采用免疫组化染色法检测并比较膀胱癌组织和正常膀胱组织中MFN2、Bmi-1蛋白表达情况,分析MFN2、Bmi-1蛋白表达与膀胱癌患者临床特征的关系,以及膀胱癌组织中MFN2蛋白与Bmi-1蛋白表达的相关性.结果 膀胱癌组织中MFN2和Bmi-1蛋白的阳性表达率分别为52.50％和61.25％,高于正常膀胱组织的12.50％和17.50％(P﹤0.05);TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率为67.27％,明显高于TNM分期为Ⅲ期患者的20.00％(P﹤0.01);肿瘤直径﹥3 cm、TNM分期为Ⅲ期的患者膀胱癌组织中Bmi-1蛋白的阳性表达率分别为96.15％和88.00％,均明显高于肿瘤直径≤3 cm、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期患者的44.44％、49.09％(P﹤0.01);膀胱癌组织中MFN2蛋白与Bmi-1蛋白的表达情况呈负相关(r=-0.602,P﹤0.01).结论 膀胱癌组织中MFN2、Bmi-1蛋白表达水平较高;MFN2蛋白阳性表达情况与TNM分期有关,Bmi-1蛋白阳性表达情况与肿瘤直径、TNM分期有关;MFN2蛋白与Bmi-1蛋白的表达情况呈负相关.
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重组pEGFP-Mfn2真核表达载体的构建及转染人乳腺癌细胞系MCF-7
目的:构建Mfn2基因真核表达载体,将此载体转染入人乳腺癌细胞系MCF-7,并观察高表达Mfn2对MCF-7增殖的影响.方法:1)设计pEGFP-Mfn2质粒,并将其用脂质体转染入人乳腺癌细胞系MCF-7； 2)DNA测序、RT-PCR法、流式细胞术及免疫细胞化学法鉴定以上述载体是否转染成功；3)MTT法检测转染后Mfn2对MCF-7细胞增殖的影响.结果:1)重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入小鼠Mfn2的全长编码基因,DNA序列测定的结果与预期设计基本一致.普通PCR琼脂糖凝胶电泳显示转染后MCF-7细胞中存在外源性Mfn2的表达.2)琼脂糖凝胶电泳检测显示实验组中Mfn2较对照组明显升高,转染Mfn2后MTT法检测转染pEGFP-Mfn2组的MCF-7细胞数明显低于空白对照组与转染pEGFP-N1组,P＜0.05.3)细胞免疫化学显示转染Mfn2后MCF-7细胞数目减少,癌细胞出现核碎裂现象.结论:成功构建了Mfn2基因真核表达载体,并成功转染MCF-7细胞.转染Mfn2后,MCF-7细胞的增殖受到明显抑制.
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运动预处理影响线粒体形态变化以及相关因子表达干预力竭运动后大鼠额叶细胞凋亡
目的:从线粒体形态结构变化以及检测相关调控因子的表达,探讨运动预处理干预力竭运动后大鼠额叶损伤的可能机制.方法:36只雄性SD大鼠随机分为对照组(C组,n=12)、力竭运动组(EE组,n=12)、运动预处理组(EP组,n=12).EP组进行持续4周的无负重60 min/day游泳训练后,EE组和EP组进行无负重一次性力竭游泳运动.运动结束后24 h,采用灌注取材和直接断头取材.用HE染色和透射电镜观察额叶神经元及神经元线粒体的形态结构;用TUNEL法检测细胞凋亡指数(AI),分析各组大鼠额叶神经元凋亡情况;用Real-Time PCR和Western blotting检测线粒体分裂和融合相关因子——Drp1和Mfn2 mRNA和蛋白表达水平.结果:一次性力竭运动引起了大鼠额叶神经元及神经元线粒体形态结构的异常.TUNEL法检测发现EE组大鼠大脑额叶神经元AI较EP组显著增加(P＜0.05).一次性力竭运动引起了Drp1和Mfn2 mRNA转录和蛋白的高表达,其中,EP组大鼠大脑额叶Mfn2表达强度较EE组显著升高(P＜0.05),EP组大鼠大脑额叶Drp1表达强度较EE组显著下降(P＜0.05).结论:Drp1的表达水平与力竭运动后额叶细胞凋亡程度密切相关,而Mfn2的表达增加能够减轻力竭运动引起的脑细胞凋亡水平.4周的游泳训练运动预处理,能够相对减少Drp1表达而上调Mfn2基因表达,影响大鼠额叶线粒体的形态结构变化,增强脑对运动性缺血缺氧的耐受力,减轻一次性力竭运动造成的大鼠额叶缺血缺氧性损伤.
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依达拉奉在大鼠局灶性脑缺血细胞中对Drp1和Mfn2动态变化的影响
目的 探讨依达拉奉在大鼠局灶性脑缺血细胞中对Drp1及Mfn2动态变化的影响及其保护机制.方法 采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,并将72只大鼠采用数字表法随机分为假手术组、脑缺血组、依达拉奉组,每组又根据时间的不同分为1、3、7天3个不同亚组.HE染色观察大脑皮质神经元形态结构,Western blot法检测Drp1及Mfn2的蛋白含量,RT-PCR检测Drp1及Mfn2mRNA基因的表达情况.结果 脑缺血组的Drp1蛋白表达量明显高于假手术组及依达拉奉组(P＜0.05),在第1、3、7天中的表达呈递增的趋势,给予依达拉奉治疗后,可以下调Drp1蛋白的表达,差异有统计学意义(P＜0.05);脑缺血组的Mfn2蛋白表达量明显低于假手术组及依达拉奉组(P＜0.05),在第1、3、7天中的表达呈递减的趋势,给予依达拉奉治疗后可上调Mfn2蛋白的表达,差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR表达结果与Western blot法检验结果一致.结论 依达拉奉治疗大鼠脑缺血可能与依达拉奉减少氧自由基生成、维持线粒体动态平衡使Drp1表达减少,Mfn2表达增多有关,从而发挥神经保护作用.
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过表达Mfn2对人乳腺癌裸鼠移植瘤血管表皮生长因子受体的影响
目的 探讨过表达线粒体融合素-2(Mitofusin-2,Mfn2)对表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)表达的影响及对人乳腺癌裸鼠移植瘤生长、血管形成的影响.方法 分别构建稳定转染空质粒pEGFP-N1(MCF-7 pEGFP-N1)及转染Mfn2质粒的pEGFP-Mfn2(MCF-7 pEGFP-Mfn2)的MCF-7细胞稳系.分别将人乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7 pEGFP-N1、MCF-7 pEGFP-Mfn2接种于裸鼠右侧乳房垫内,观察裸鼠生长状况,每周两次测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线.5周后处死裸鼠,采用免疫组化验证肿瘤Mfn2蛋白的表达并检测CD34来观测肿瘤微血管密度(MVD),检测EGFR蛋白的表达情况.结果 pEGFP-Mfn2组肿瘤明显小于pEGFP-N1组和对照组(P＜0.05).pEGFP-Mfn2组微血管数目明显小于pEGFP-N1组和对照组(P＜0.05).pEGFP-N1组EGFR的表达与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),与对照组、pEGFP-N1组相比pEGFP-Mfn2组EGFR的表达明显降低(P＜0.05).结论 Mfn2明显抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长.下调EGFR表达、减少微血管生成可能为其抗肿瘤机制.
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线粒体融合蛋白2低表达诱导绒毛滋养层细胞自噬的发生
目的 观察线粒体融合蛋白2 (Mfn2) siRNA转染人绒毛滋养细胞后自噬的发生情况.方法 构建Mfn2 siRNA真核表达载体,电穿孔法将Mfn2 siRNA稳定转染人绒毛滋养层细胞并进行培养,获得Mfn2表达抑制的滋养层细胞.设立实验组(转染Mfn2 siRNA序列)、阴性转染组(转染Cy3 siRNA序列)、空白对照组(未转染序列).采用Western Blot检测3组细胞转染后Mfn2及自噬相关基因Beclin1和Atg5的表达水平;采用免疫荧光化学染色检测LC3Ⅱ在3组绒毛滋养层细胞中的表达率.结果 相对比阴性转染组和空白对照组,实验组Mfn2蛋白水平显著降低,Beclin1和Atg5蛋白表达水平增加;免疫荧光化学染色显示,LC3Ⅱ荧光光点表达率增加.结论 Mfn2低表达诱导Beclin1和Atg5的表达增加,进而诱导绒毛滋养层细胞自噬小体出现和自噬的发生,提示Mfn2可能通过调控绒毛滋养层细胞自噬参与胚胎发育.
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MFN2、Survivin和nm23在卵巢癌中的表达及其意义
目的:探讨MFN2、Survivin和nm23在卵巢癌中的表达及意义.方法:用免疫组化法检测MFN2、Survivin和nm23在不同卵巢组织中的表达情况.结果:①MFN2阳性染色定位于胞质,呈棕黄色颗粒,与正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组比较,恶性卵巢癌组MFN2累积光密度值高表达,差异有统计学意义(P＜0.05).②survivin阳性染色主要位于呈棕黄色颗粒的细胞核,与正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组比较,恶性卵巢癌组survivin的累积光密度值表达率呈上升趋势,差异均有统计学意义(P＜0.05).③nm23阳性染色主要位于细胞基质中,为棕黄色细颗粒,nm23在恶性卵巢癌组的累积光密度值呈上升趋势,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:MFN2、Survivin和nm2在恶性卵巢癌组织中表达上调,与卵巢癌淋巴结转移和临床病理分期密切相关.
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MFN2和nm23在不同卵巢组织中的表达
目的:探讨MFN2和nm23在不同卵巢组织中的表达及其意义.方法:用免疫组化法检测MFN2和nm23在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、恶性卵巢癌组的表达情况.结果:①MFN2阳性染色主要位于细胞浆,呈棕黄色颗粒,在恶性卵巢癌组表达率呈上升趋势,差异均有显著性(P＜0.05).②nm23阳性染色主要位于细胞基质中,为棕黄色细颗粒,在恶性卵巢癌组表达率呈上升趋势,差异均有显著性(P＜0.05).结论:MFN2和nm23在恶性卵巢癌组织中表达较高.
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Mfn2调节线粒体自噬
线粒体融合蛋白2(Mfn2)是由位于人体1号染色体短臂36.22上的Mfn2基因所编码的一种高度保守的跨膜GTP酶,位于线粒体外膜或内质网.Mfn2可调控线粒体融合、转运及线粒体自噬,胰岛素抵抗,抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,通过线粒体-内质网结构偶联参与内质网应激调控等.本文概括介绍Mfn2的结构和功能基础,总结Mfn2调控线粒体自噬机制及其在线粒体-内质网结构偶联中的作用的研究新进展.
关键词： Mfn2 线粒体自噬 线粒体融合蛋白 线粒体-内质网结构偶联 -
线粒体自噬新研究进展
活性氧由线粒体产生且作用于线粒体.在压力环境下,选择性降解损伤的线粒体,并维持正常的线粒体数量对维持细胞的正常结构、生长起重要作用.线粒体通透性改变、过氧化氢酶失活等诸多影响因素都会促进线粒体自噬的发生.近研究发现PINK1-Parkin信号通路,Mfn1、Mfn2和OPA1等蛋白与线粒体关系紧密,调控线粒体的融合、分裂、自噬.线粒体自噬可能导致神经退行性疾病,主要的神经退行性疾病包括帕金森病(Parkinson's disease,PD)、肌萎缩侧索硬化症(Alzheimer's disease,AD)、亨廷顿舞蹈病等(Huntington's disease,HD),这些与线粒体的动态改变有关.
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JKA97诱导HepG2凋亡及其分子机制研究
目的:研究药物JKA97对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及其分子机制.方法:采用MTT法观察药物JKA97对细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot方法检测线粒体融合蛋白mfn2表达水平变化.结果:药物JKA97抑制人肝癌细胞HepG2细胞增殖,5、10、20 μmol/L作用组24 h抑制率分别为34.26%、43.08%、54.02%;药物JKA97诱导人肝癌细胞HepG2凋亡,10、20 μmol/L JKA97作用HepG2细胞24h,细胞凋亡率分别为22.9%、72.9%;线粒体融合蛋白mfn2表达水平显著降低.结论:药物JKA97对人肝癌细胞HepG2生长具有明显的增殖抑制作用,诱导细胞凋亡;线粒体融合蛋白mfn2表达水平降低可能是其重要的分子机制之一.
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丁苯酞联合依达拉奉对大鼠局灶性脑缺血细胞中Drp1及Mfn2动态变化的影响及其保护机制
目的 脑缺血后神经细胞发生氧化应激诱导细胞凋亡,从而打破线粒体的分裂融合的动态平衡.文章探讨丁苯酞联合依达拉奉对大鼠局灶性脑缺血细胞中Drp1及Mfn2动态变化的影响及其保护机制. 方法 将96只大鼠按随机数字表法分为缺血组、丁苯酞组、依达拉奉组、丁苯酞注射液联合依达拉奉组(联合用药组),每组又根据时间分为3、7、14 d的不同亚组,采用Longa-Zea线栓法建立大脑中动脉缺血模型.丁苯酞组、依达拉奉组及联合用药组分别从术前2 h及术后第1天开始腹腔注射依达拉奉10 mL/kg,丁苯酞注射液0.4 g/kg.脑缺血组在相同时间给予相同计量的等渗盐水.分别于第3、7、14天断头取左侧缺血区大脑皮质.采用神经功能学评分进行疗效评价.HE染色观察大脑皮质神经元形态结构,Western blot检测Drp1及Mfn2的蛋白含量,RT-PCR检测Drp1及Mfn2的mRNA的表达量. 结果 第3、7、14天,与脑缺血组比较,丁苯酞组、依达拉奉组、联合用药组评分降低(P<0.05);与联合用药组第3、7、14天神经功能缺损评分[(1.06±0.18)、(0.82±0.13)、(0.57±0.10)分]比较,丁苯酞组[(2.02±0.18)、(1.23±0.13)、(0.86±0.10)分]、依达拉奉组[(2.08±0.17)、(1.23±0.13)、(0.85± 0.12)分]增加(P<0.05).在相同时间水平下,与脑缺血组比较,丁苯酞组、依达拉奉组及联合用药组Drp1蛋白及mRNA表达量减少(P<0.05).联合用药组Drp1蛋白及mRNA表达量减少(P<0.05).与依达拉奉组比较,联合用药组Drp1蛋白及mRNA表达量减少(P<0.05);在相同时间水平下与脑缺血组比较,丁苯酞组、依达拉奉组及联合用药组Mfn2蛋白及mRNA表达量增多(P<0.05).与丁苯酞组比较,联合用药组Mfn2蛋白及mRNA表达量增多(P<0.05).与依达拉奉组比较,联合用药组Mfn2蛋白及mRNA表达量增多(P<0.05). 结论 依达拉奉联合丁苯酞对脑缺血的保护作用效果强于单独使用,其机制可能与依达拉奉清除氧自由基,减少氧化应激,丁苯酞保护线粒体有关.
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Mfn2过表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖能力影响的研究
目的：探讨Mfn2对卵巢癌SKOV3细胞株增殖能力的影响，评价Mfn2在卵巢癌发生发展中的作用。方法体外培养人卵巢癌细胞株SKOV3，通过慢病毒包装Mfn2并转染卵巢癌SKOV3细胞株，将其分为3组：转染Mfn2组（SKOV3/Lenti-Mfn2组）、转染阴性对照组（SKOV3/Lenti-EGFP组）和空白对照组（SKOV3组），Western blot检测Mfn2蛋白表达，流式细胞仪检测细胞周期，分析转染Mfn2后细胞周期的变化。结果转染Mfn2后卵巢癌细胞株呈短梭形改变，片状伪足减少。Western blot检测3组细胞Mfn2蛋白表达，SKOV3/Lenti-Mfn2组较两对照组显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）。转染Mfn2后Mfn2表达组（SKOV3/Lenti-Mfn2组）、转染阴性对照组（SKOV3/Lenti-EGFP组）和空白对照组（SKOV3组）S期细胞平均比例分别为（37.4±1.1）％、（43.7±0.8）%和（66.3±0.4）%，而 G1细胞比例分别为（48.1±2.2）%、（43.6±1.0）%和（24.1±2.0）%，Mfn2表达组与其他两组比较，Mfn2表达组的细胞S期增殖指数较低，而停留在G1期的细胞比例则较高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Mfn2基因过表达后，SKOV3卵巢癌细胞增殖指数降低，表明Mfn2基因上调可以抑制SKOV3细胞的增殖。
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癫痫大鼠海马线粒体融合分裂相关基因的表达变化
观察大鼠癫痫持续状态后线粒体融合分裂相关基因Mfn2和Drp1在海马中的动态变化,探讨线粒体融合分裂在癫痫发生中的作用. 随机将成年雄性Wistar大鼠48只分为对照组、癫痫持续状态(status epilepticus,SE)后2h、8h及24 h组,后3组建立氯化锂-匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫持续状态模型.观察各组大鼠行为学变化;采用Nissl染色检测海马神经元损伤;采用实时定量PCR(real time quantitativePCR,QT-PCR)方法观察大鼠海马Mfn2及Drp1 mRNA表达变化. ①与对照组相比,SE组可见大鼠海马CA1和CA3区细胞正常结构破坏、神经元脱失等改变,以癫痫发作后24 h显著.②与对照组相比,SE后Mfn2 mRNA表达均较对照组显著降低(F=5.362,P=0.006),而Drp1 mRNA表达均较对照组显著升高(F =6.655,P=0.002). 线粒体融合分裂失平衡可能是造成癫痫神经损伤的重要原因.
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Mfn2基因对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞形成及ABCA1表达的影响
目的:观察Mfn2基因对ox-DL刺激下RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响及其机制.方法:通过细胞内胆固醇浓度检测,分析过表达或者干扰Mfn2基因表达对RAW264.7细胞在ox-LDL刺激下泡沫细胞内胆固醇含量和胆固醇酯/总胆固醇比例的影响;通过实时定量PCR和Western blot检测Mfn2基因对细胞胆固醇外排蛋白ABCA1 mRNA和蛋白水平的影响.结果:RAW264.7细胞过表达Mfn2基因,分别降低细胞内16.3％总胆固醇含量和19.8％胆固醇酯/总胆固醇比例;而干扰RAW264.7细胞Mfn2基因表达,分别增加细胞内45.9％总胆固醇含量和26.7％的胆固醇酯/总胆固醇比例.40 pfu和60 pfu adv-Mfn2感染均促进RAW264.7细胞ABCA1的mRNA表达(分别增加26.5％和60.5％),而仅60 pfu adv-Mfn2感染促进RAW264.7细胞ABCA1的蛋白表达(增加40.6％).结论:Mfn2可能通过促进ABCA1的表达,减少细胞内胆固醇的沉积.
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线粒体融合与分裂的分子机制及相关疾病的研究进展
线粒体是细胞能量代谢的中心,线粒体的网格形态可通过其融合与分裂而处于一种动态的变化中,以此适应不同环境下的能量需求.线粒体融合蛋白Mitofusin1/2(Mfn1/2),视神经萎缩蛋白(OPA1)和线粒体分裂蛋白(Drp1)分别在线粒体的融合和分裂过程中起到了关键的调节作用.而线粒体融合与分裂功能的异常,参与了人体各个系统许多损伤过程,包括视神经萎缩、缺血再灌注损伤等.本文将回顾上述几种关键蛋白为代表的线粒体融合与分裂关键调控分子、调节机制以及其异常所造成的疾病.
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线粒体、Mfn2与肿瘤及细胞周期关系的研究
线粒体是真核细胞中的一类重要细胞器，除了作为能量产生的场所外，还参与包括肿瘤等多种疾病的发生与发展。线粒体融合蛋白2是定位于线粒体外膜并参与线粒体功能调节的一类高度保守的蛋白质。近年来对线粒体及相关因子的研究越来越成为学术界的热点话题。
