首页 > 文献资料
-
细胞自噬在砷暴露所致肺损伤中的作用
目的 探讨细胞自噬在砷暴露所致大鼠肺损伤中的作用.方法 24只无特定病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠随机分为4组,即对照组,砷暴露低(10μg/L)、中(100 μg/L)、高(1 000μg/L)剂量组,砷暴露组通过自由饮用含NaAsO2的水进行染毒,对照组自由饮用不含NaAsO2的水,染毒28 d后统一处死.ELISA法测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的含量.Western blot法检测肺组织中自噬相关蛋白NBR1、p62、LC3Ⅱ表达量.结果 砷暴露组大鼠BALF中促炎因子TNF-a、IL6、IL8表达量显著高于对照组(P＜0.05),且100μg/L组的IL-6高;砷暴露1 000 μg/L组的抑炎因子IL-10含量显著低于对照组(P＜0.05);与对照组相比砷暴露组大鼠肺组织中p62、NBR1的表达量增加(P＜0.05),且存在剂量-反应关系;与对照组相比砷暴露组大鼠肺组织中LC3Ⅱ蛋白表达量显著下降(P＜0.05),且存在剂量-反应关系.结论 砷暴露所致大鼠肺损伤中,细胞自噬被抑制时会加重大鼠肺部的炎症损伤,当NaAsO2暴露浓度达到100 μg/L时,会对大鼠肺组织造成明显的损伤.
-
番鸭呼肠孤病毒感染诱导细胞自噬的研究
本研究通过透射电镜观察自噬体的形态学结构,蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞自噬相关蛋白LC3 Ⅱ和磷酸化mTOR (p-mTOR)表达量的动态变化趋势,探索番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染对细胞自噬的影响.结果显示,MDRV-YB株感染的DF-1细胞中可见典型的包裹胞浆成分的双层膜结构;MDRV感染番鸭成纤维细胞(MDFs)和DF-1细胞后0～60h内,其LC3Ⅱ表达量均呈现先升高后降低的趋势,且均在感染后36 h达到大值,其p-mTOR表达量均呈现先降低后回升的趋势,且分别在感染后36h和24h达到低值;灭活MDRV组细胞未见LC3Ⅱ表达.结果表明MDRV能够诱导感染的MDFs和DF-1细胞持续较长时间细胞自噬,而灭活的MDRV不能引起细胞自噬.
-
激活自噬减轻心肺复苏后Wistar大鼠脑损伤
目的 观察自噬(autophagy)在心肺复苏(CPR)后Wistar大鼠脑损伤中的作用.方法 实验一:36只健康成年雄性Wistar大鼠通过体外交流电刺激诱发心室颤动(VF),VF (0)前和ROSC后1、2、4、8、12 h取大脑皮层观察beclin-1和LC3Ⅱ的表达.实验二:60只Wistar大鼠随机(随机数字法)分为对照组(control)、自噬激活剂雷帕霉素组(Rapamycine)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(3-MA).VF前1h分别向腹腔内注入生理盐水或雷帕霉素1 mg/kg或3-甲基腺嘌呤30 mg/kg.ROSC后2、4h取大脑皮层,用电镜和Western blot方法观察神经元自噬的激活,免疫荧光观察LC3颗粒的形成;24、48、72 h进行NDS评分;72h后取大脑皮层行HE染色和TUNEL染色计数顶叶皮层存活神经元细胞数和凋亡神经元细胞数.beclin-1、LC3Ⅱ表达和神经元计数用单因素方差分析,NDS比较用秩合检验.结果 实验一中28只Wistar大鼠复苏成功.ROSC后2、4h自噬基因beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显低于VF前(P＜0.05),而ROSC后8、12h的表达与VF前差异无统计学意义.Rapamycine组动物ROSC后2、4h大脑皮层beclin-1的表达和LC3Ⅱ的转换明显高于Control组和3-MA组,P＜0.05.ROSC后2、4 h Rapamycine组自噬泡数量明显多于Control组和3-MA组;ROSC后4 h Rapamycine组LC3颗粒数也明显多于Control组和3-MA组.ROSC后72 h Rapamycine组动物大脑皮层存活的神经元细胞数多于Control组和3-MA组(P＜0.05);凋亡神经元细胞数Rapamycine组少于Control组和3-MA组(P＜0.05).ROSC后24、48、72 h Rapamycine组的NDS评分优于control组和3-MA组(P＜0.05).结论 ROSC后早期大脑皮层神经元beclin-1和LC3-Ⅱ表达下降,通过雷帕霉素促进beclin-1和LC3-Ⅱ表达可以保护神经元细胞和改善神经功能.
-
尼古丁对血管内皮细胞自噬的影响
目的:初步探讨尼古丁对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endotheliel cell,HUVEC)自噬的影响.方法:采用蛋白免疫印迹(Western blot)技术分别检测尼古丁不同浓度(0、6×10-8、6×10-7、6×10-6和6×10-5mol/L)和不同时间(浓度为6×10-6mol/L时,分别干预0、1.5、3、6和12h)作用后,人脐静脉内皮细胞中自噬标志性蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)蛋白表达水平的变化,以确定尼古丁的佳刺激浓度和佳刺激时间.依据尼古丁佳条件将体外培养的HUVE细胞随机分组:对照组、尼古丁处理组,Western blot法检测LC3Ⅱ、多聚泛素结合蛋白p62/ SQSTM1 (p62)和溶酶体相关膜蛋白-2(LAMP-2)的蛋白表达,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率.结果:体外实验显示,LC3Ⅱ蛋白表达呈浓度和时间依赖性,且尼古丁浓度为6×10-6mol/L、时间为6h时,LC3Ⅱ蛋白表达多(P＜0.01).与对照组相比,尼古丁处理组LC3Ⅱ、p62蛋白表达显著增加(P＜0.05),LAMP2蛋白表达减少(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.01).结论:尼古丁可以引起自噬体与溶酶体融合障碍,使自噬降解异常,导致内皮细胞自噬功能紊乱,促进细胞凋亡.
-
自噬对不同低氧条件下PC12细胞存活的影响
目的:探讨不同低氧对细胞存活和自噬的调节作用.方法:采用不同氧含量处理大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12),MTT方法检测细胞存活情况；Western blot检测自噬特异性标记物微管相关蛋白轻链3(LC3)和接头蛋白p62的表达变化；流式细胞分析测定低氧及阻断自噬后活性氧水平(ROS)的变化情况.结果:不同低氧细胞存活能力不同:适度低氧促进细胞存活,严重低氧导致细胞存活能力下降；自噬标记蛋白在不同低氧下表达水平不同:适度低氧使LC3-Ⅱ和p62表达增加,严重低氧则反之,LC3-Ⅱ和p62表达降低；与常氧相比,适度低氧没有改变ROS水平,严重低氧使ROS水平增加；用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后,各种氧含量下的ROS水平都被升高,其中,适度低氧与严重低氧ROS升高幅度明显高于常氧情况.结论:适度低氧促进细胞存活,严重低氧导致细胞死亡,自噬活性介导了不同低氧的作用效果.
-
线粒体融合蛋白2低表达诱导绒毛滋养层细胞自噬的发生
目的 观察线粒体融合蛋白2 (Mfn2) siRNA转染人绒毛滋养细胞后自噬的发生情况.方法 构建Mfn2 siRNA真核表达载体,电穿孔法将Mfn2 siRNA稳定转染人绒毛滋养层细胞并进行培养,获得Mfn2表达抑制的滋养层细胞.设立实验组(转染Mfn2 siRNA序列)、阴性转染组(转染Cy3 siRNA序列)、空白对照组(未转染序列).采用Western Blot检测3组细胞转染后Mfn2及自噬相关基因Beclin1和Atg5的表达水平;采用免疫荧光化学染色检测LC3Ⅱ在3组绒毛滋养层细胞中的表达率.结果 相对比阴性转染组和空白对照组,实验组Mfn2蛋白水平显著降低,Beclin1和Atg5蛋白表达水平增加;免疫荧光化学染色显示,LC3Ⅱ荧光光点表达率增加.结论 Mfn2低表达诱导Beclin1和Atg5的表达增加,进而诱导绒毛滋养层细胞自噬小体出现和自噬的发生,提示Mfn2可能通过调控绒毛滋养层细胞自噬参与胚胎发育.
-
电针对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及LC3Ⅱ、P62表达水平的影响
目的 研究电针对APP/PS1双转基因小鼠自噬相关蛋白LC3Ⅱ及受体蛋白P62相关的作用机制.方法 将7月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、电针治疗组,以同窝转基因阴性小鼠为正常对照组.电针治疗组予电针涌泉、百会,15 min/次,隔日1次,治疗6周,利用Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力以及用Western blot法检测小鼠海马区域LC3Ⅱ及P62蛋白的表达.结果 水迷宫结果显示,模型组与正常对照组比较,逃避潜伏时增加(P<0.01);WB结果显示,与对照组相比,模型组LC3Ⅱ表达增强,P62表达减弱(P<0.05);与模型组相比,针刺组LC3Ⅱ表达减弱,P62表达增强(P<0.05).结论 APP/PS1转基因鼠存在神经元自噬途径功能亢进,电针可能通过抑制自噬水平,从而改善学习记忆功能.
-
晚期糖基化终末产物(AGEs)对人软骨细胞自噬活性的影响研究
目的 探究晚期糖基化终末产物(AGEs)对人软骨细胞自噬活性的影响.方法 (1)人软骨胞采用不同度的AGEs处理不同时间,采用CCK-8法检测细胞的活性.(2)AGEs浓度为100 mg/L处理人软骨细胞0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h后采用WB方法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的表达.(3)不同浓度的AGEs(50 mg/L,100 mg/L,200 mg/L)处理软骨细胞24 h后,采用WB方法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的表达.结果 (1)CCK-8结果显示:在一定浓度范围内,AGEs处理人软骨胞的活性在短时间内(24 h之内)随时间的变化升高(与对照组比较P<0.05);在一定时间范围内,低浓度AGEs(100 mg/L)使人软骨胞的活性升高,高浓度AGEs(200 mg/L)使人软骨胞的活性降低(与对照组比较P<0.05).(2)AGEs浓度为100 mg/L处理人软骨细胞LC3-Ⅱ的表达随时间的变化明显增加,与对照组比较在24 h后更为明显(P<0.05).(3)不同AGEs浓度处理人软骨细胞24 h后,LC3-Ⅱ的表达明显高于对照组(P<0.05).结论 低浓度的AGEs在短时间内可能通过调节软骨细胞自噬增强细胞活性.长期的或者高浓度的AGEs使人软骨细胞自噬降低影响细胞的活性.
关键词： 人软骨细胞 AGEs(晚期糖基化终末产物) 细胞自噬 LC3Ⅱ -
多种细胞自噬调节剂对自噬标记物LC3Ⅱ及p62表达的影响
利用Western杂交检测自噬标记物LC3Ⅱ和p62的表达是评价细胞自噬活性的常用方法.为了比较作用于不同靶点的细胞自噬调节剂对LC3Ⅱ和p62表达的影响,分别利用以mTOR依赖或非依赖方式活化细胞自噬的雷帕霉素或海藻糖、抑制自噬起始的3-甲基腺嘌呤、抑制自噬小体与溶酶体融合的巴弗洛霉素A1 以及抑制溶酶体酶活性的E64d和pepstatin A处理HEK293细胞,通过Western杂交检测LC3Ⅱ和p62的表达.结果显示,雷帕霉素增强LC3I向LC3Ⅱ转化,促进p62 降解,而海藻糖仅引起LC3Ⅱ表达的上调;阻断细胞自噬过程各个阶段均导致LC3Ⅱ和p62 堆积,并呈现出剂量和时间依赖性.这些结果提示尽管LC3Ⅱ和p62均为自噬标记物,但不同的调节剂对其表达的调控存在差异.
-
3-methyladenine下调自噬对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响
目的：探讨自噬对脑缺血再灌注损伤的影响。方法54只CD-1小鼠随机分为假手术对照组6只，缺血再灌注组24只，盐水对照组9只和3-MA组15只。缺血再灌注组再分为6、12、24和48h组，每组6只。采用线拴法建立t-MCAO模型。假手术组和缺血再灌注组小鼠不给药，盐水对照组小鼠给予5μL生理盐水；3-MA组小鼠麻醉后置于立体定位架，术前30min用Hamilton注射器于左侧侧脑室定位后分别注射5μL浓度为2、10、50mM的3-MA。采用Western blot半定量检测再灌注后缺血侧/左侧皮层、海马和纹状体LC3Ⅱ蛋白表达变化，TTC染色观察3-MA（10mM）组和对照组缺血再灌注后24h脑梗死体积及水肿率。结果缺血再灌注组6、12、24、48h皮层、海马和纹状体LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达均有升高趋势，其中皮层和海马区LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达于24h升高为明显，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而缺血再灌注组各个时间点纹状体区LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量与假手术组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；与盐水对照组比较，3-MA（10mM）组小鼠脑梗死体积明显减少[（26.72±1.53）mm3对（51.80±2.85）mm3，P<0.001]，水肿率明显降低[（7.82±0.75）%对（16.55±4.47）%，P<0.01]。结论自噬的下调对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用。
关键词： 小鼠 缺血再灌注 自噬 3-Methyladenine LC3Ⅱ -
血清浓度对心肌细胞自噬的影响磁
目的：观察不同血清浓度对心肌细胞自噬的影响。方法以大鼠胚胎心肌细胞系H9c2为标本，建立3个时间点6、12、24 h ，以及四个不同浓度0、2、5、10％来检测细胞的自噬程度。运用Western Blot检测心肌细胞LC3Ⅱ、P62的变化，吖啶橙染色检测酸性膜泡。结果培养6 h之前，较高浓度10％血清自噬程度低，6～12 h随着血清浓度增高自噬被促进。24 h后去血清组促进自噬，添加2，5，10％血清均能抑制自噬。结论在筛选促进自噬的因子时，应选择背景自噬较低的模型，作用效果在6 h之内的因子首选10％血清培养的心肌细胞，作用效果在6～12 h之间的选择无血清培养体系，作用效果在24 h之后的可选择有血清培养体系。
-
LC3Ⅱ及P62在小胃间质瘤中的表达及意义
目的 通过检测小胃间质瘤和正常胃间质组织中自噬相关基因LC3Ⅱ和P62的表达情况,探讨LC3Ⅱ和P62在胃间质瘤发生、发展中的作用.方法 采用免疫组织化学染色法,检测LC3Ⅱ和P62在21例小胃间质瘤组织、16例正常胃间质组织中的表达情况.试验组:选取2013年1月-2014年5月在皖南医学院弋矶山医院内镜切除的21例小胃间质瘤病例,中位年龄52岁.对照组:选取同期16例因"消化性溃疡"在皖南医学院戈矶山医院行胃大部切除术的病例,术后病理证实胃组织正常者,中位年龄47岁.采用免疫组织化学法(非生物素二步法)分别检测LC3Ⅱ和P62在小胃间质瘤和正常胃间质组织中的表达,免疫组化结果采用半定量综合分析法.结果 正常胃间质组织和小胃间质瘤组织中LC3Ⅱ、P62的阳性率均为100%.与正常胃间质组织相比,小胃间质瘤组织LC3Ⅱ表达明显增强,P62表达减弱,差异有统计学意义(P=0.000).结论 小胃间质瘤自噬活性增加,可能与肿瘤发生、发展有关.
