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FAK突变体的亚细胞定位及生物学特性
目的：探讨外显子33缺失型黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）突变体（FAK-Del33）的亚细胞定位及生物学特性。方法采用基础实验研究设计。将野生型FAK以及突变型FAK-Del33分别构建到pEGFP表达载体,并转染乳腺癌细胞株,以研究分析其细胞表达和定位情况。另构建过表达FAK或FAK-Del33的MDA-MB-468乳腺癌稳转细胞株，研究评价其细胞表达和体外克隆形成能力。结果构建FAK-GFP融合蛋白表达载体转染MDA-MB-468后的细胞定位显示，野生型FAK在胞浆中弥散分布，而FA K突变体蛋白在胞浆中呈点状不均匀分布，并聚集成簇。经限制性内切酶酶切分析与测序分析，成功构建出过表达FAK的慢病毒载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染乳腺癌细胞；经抗生素puromycin筛选和荧光定量PCR鉴定，成功筛选到稳定表达FAK的细胞株。在软琼脂克隆形成实验中，FAK野生型的克隆形成数为（335±48）/1000个，FAK突变体为（735±91）/1000个，后者对MDA-MB-468乳腺癌稳转细胞株的增殖能力高于前者（t=9.437， P＜0.01）。结论初步研究表明外显子33缺失可改变FAK的亚细胞定位；并能增强肿瘤细胞株的体外克隆形成能力，这种FAK突变体可能参与肿瘤的发生发展。
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针刀对膝骨关节炎兔软骨细胞磷酸化黏着斑激酶 、磷酯酰肌醇-3激酶 、聚集蛋白聚糖基因及蛋白表达的影响
目的:观察针刀对膝骨关节炎(KOA)兔关节软骨磷酸化黏着斑激酶(p-FAK)、磷酸化磷酯酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因和蛋白表达的影响,探讨针刀干预促进软骨细胞修复的可能力学转导通路.方法:新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、模型抑制剂组、针刀组、针刀抑制剂组、电针组、电针抑制剂组,每组7只.采用改良Videman左后肢伸直位固定制动法复制KOA模型.电针组、电针抑制剂组电针左侧"梁门""血海""内膝眼""外膝眼",每周3次,治疗4周.针刀组、针刀抑制剂组分别采用针刀治疗,每周2次,治疗4周.采用Real-time PCR法和Western blot法检测各组家兔膝关节软骨p-FAK、p-PI3K、Aggrecan基因和蛋白表达水平.结果:与正常组相比,模型组p-FAK、p-PI3K mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),Aggrecan mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.01).与模型组比较,电针组p-FAK、p-PI3K、Aggrecan蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),针刀组p-FAK、p-PI3K、Aggrecan mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01).与电针组相比,针刀组p-FAK蛋白及p-PI3K、Aggrecan mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01).与相同干预方法组相比,模型抑制剂组(除p-PI3K mRNA外)、电针抑制剂组、针刀抑制剂组p-FAK、p-PI3K、Aggrecan mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.05,P<0.01).结论:FAK-PI3K信号通路在针刀干预后关节软骨的修复过程中起到了重要的介导作用.
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加味四君子汤对阿霉素肾病大鼠FAK/p38MAPK途径的影响
目的:探讨加味四君子汤对阿霉素肾病大鼠的治疗作用及对FAK/p38途径的影响.方法:建立阿霉素肾病综合征大鼠模型,以随机数字表随机分为正常组、模型组、激素组、中药组(加味四君子汤)、中药+激素组,每组10只.测大鼠24h尿蛋白;电镜下进行肾脏超微病理观察,实时荧光定量PCR检测肾组织FAK、p38mRNA表达,Western Blot检测肾皮质FAK、p38蛋白及磷酸化.结果:①第21天,激素组、中药组、中药+激素组尿蛋白均较模型组降低(P＜0.05,P＜0.01).第35天,与模型组比较,3组尿蛋白均显著性降低(P＜0.01).第35天与第21天相比,模型组显著性升高、激素组和中药+激素组显著性降低(P＜0.05).②模型组足细胞肿胀,足突增宽、部分或弥漫性融合;各治疗组肾小球病变明显减轻,仅见部分足突融合.③与模型组比较,各药物干预组FAK mRNA、p38 mRNA表达显著性减少(P＜0.01).④模型组FAK总蛋白及FAK、p38磷酸化蛋白显著性增高(P＜0.01),与模型组比,各药物干预组FAK总蛋白及FAK、p38磷酸化蛋白显著性降低(P＜0.05).结论:阿霉素可通过FAK/p38途径导致阿霉素肾病的形成;肾组织FAK磷酸化,可诱导下游p38通路激活,介导肾脏损伤;加味四君子汤、激素能抑制FAK/p38通路,降低阿霉素肾病大鼠蛋白尿.
关键词： 加味四君子汤 阿霉素肾病 黏着斑激酶 p38丝裂原活化蛋白激酶 -
β-咔啉类生物碱抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭的机制研究
该研究主要探索β-咔啉类生物碱抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭的机制与黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因表达的相关性.采用CCK-8法测定不同浓度条件下β-咔啉类生物碱对胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率;并通过Transwell小室测定β-咔啉类生物碱对SGC-7901细胞迁移与侵袭能力的影响;qRT-PCR及Western blot技术检测FAK基因mRNA及蛋白的表达差异.然后将si-FAK-1051重组质粒转染到SGC-7901细胞中,再次采用qRT-PCR及Western blot技术鉴定FAK基因沉默效果,后采用同样的方法检测FAK基因沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移的影响.随着β-咔啉类生物碱浓度增加,人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率逐渐升高,IC50=13.364 mg·L-1;阳性对照组(5-FU,5 mg·L-1)和β-咔啉类生物碱组中Transwell小室内SGC-7901细胞均可见显著减少(P＜0.01),且β-咔啉类生物碱组SGC-7901细胞数目较阳性对照组明显降低(P＜0.01);阳性对照组、β-咔啉类生物碱实验组FAK基因mRNA及蛋白表达水平较空白对照组显著降低(P＜0.05).si-FAK-1051转染入胃癌SGC-7901细胞后,FAK基因的mRNA及蛋白表达被明显下调(P＜0.05),细胞增殖和细胞迁移能力也显著降低(P＜0.05).β-咔啉类生物碱较5-FU具有更有效的抑制胃癌SGC-7901细胞迁移与侵袭能力,而该机制可能与β-咔啉类生物碱抑制FAK基因mRNA及蛋白表达水平有关.
关键词： β-咔啉类生物碱 胃癌SGC-7901细胞 黏着斑激酶 -
黏着斑激酶在机械压力诱导的人气道上皮细胞黏液分泌中的作用
目的 探讨黏着斑激酶(FAK)在机械压力诱导的人气道黏蛋白(MUC)5 AC分泌中的作用.方法 气液相界面培养人支气管上皮NHBE细胞,用Transwell压力实验装置间断性施压于NHBE细胞,黏着斑激酶(FAK) siRNA转染NHBE细胞,Western blot法检测FAK和p-ERK1/2蛋白含量,实时荧光定量PCR检测MUC5AC mRNA表达,ELISA法检测MUC5AC蛋白相对含量.结果 与空白对照组相比,机械压力能显著升高MUC5AC mRNA及蛋白含量及p-ERK1/2蛋白相对表达水平(均P＜0.01).FAK siRNA可显著降低机械压力所诱导的MUC5AC mRNA及蛋白含量的升高及p-ERK1/2蛋白表达(P＜0.01),但与转染FAKsiRNA对照组相比,机械压力+转染FAKsiRNA组细胞表达MUC5AC mRNA及蛋白水平和p-ERK1/2蛋白相对水平仍然是增加的(P＜0.05),PD98059能显著抑制机械压力所诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达水平的升高(P＜0.01).FAK siRNA联合AG1478作用于NHBE细胞则可显著抑制机械压力诱导的MUC5AC mRNA和蛋白表达(P＜0.01).AG1478单独作用能有效降低由机械压力所诱导的上述指标的升高(P＜0.05),但与AG1478对照组相比差异仍具有显著性.结论 机械压力诱导的MUC5AC高表达的信号传导通路为ERK依赖的,FAK为ERK的上游信号分子.
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大鼠肝纤维化过程中肝组织黏着斑激酶表达增加
本研究采用胆总管结扎(BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型,应用免疫组织化学、Western blotting技术及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,研究了FAK及其mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化;用免疫组织化学方法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果显示:正常肝组织有少量α-SMA、FAK分布,随着肝纤维化发展,α-SMA、FAK阳性细胞明显增多;正常大鼠肝组织中亦有FAK蛋白、FAK mRNA表达,造模4周表达多.FAK与α-SMA呈显著正相关(r=0.963,P＜0.05).提示肝纤维化形成过程中FAK及其mRNA表达明显增加,FAK在HSCs增殖及肝纤维化形成过程中发挥作用.
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OPN促进大鼠肝星状细胞黏附、迁移及黏着斑激酶活性
目的探讨细胞外间质(ECM)成分骨桥蛋白(OPN)和精-甘-天冬-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)四肽对大鼠肝星状细胞(HSCs)黏附、迁移与黏着斑激酶(FAK)活性的影响.方法应用体外细胞培养技术,MTT法检测HSCs增殖,甲苯胺蓝法检测HSCs黏附情况,并观察HSCs迁移;采用免疫沉淀和Western blot技术测定黏着斑激酶活性变化.结果①不同浓度OPN和RGDS四肽作用于HSCs 2 h后,8、16、32 mg/L OPN组细胞黏附促进率均高于对照组(P＜0.05);25 mg/L～100 mg/L RGDS四肽不同浓度组细胞黏附率明显下降(P＜0.05).②不同浓度OPN干预细胞48 h后,促进HSCs增殖,而RGDS四肽组抑制HSCs增殖.③16 mg/LOPN作用12、24和36 h,细胞迁移距离显著高于对照组(P＜0.05);而100 mg/L RGDS四肽组则显著性低于对照组(P＜0.05).④经OPN作用后各浓度组HSCs中磷酸化FAK均有显著表达;RGDS四肽干预后,磷酸化FAK表达量降低.结论①OPN促进HSCs增殖、黏附和迁移;RGDS四肽对HSCs增殖、黏附和迁移具有抑制作用.②OPN可以诱导FAK活化,RGDS四肽可抑制磷酸化FAK的表达.
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黏着斑激酶酪氨酸磷酸化促大鼠肝纤维化形成及其可能机制
目的 探讨在肝纤维化发生中,黏着斑激酶(FAK)酪氨酸磷酸化与肝星状细胞(HSC)增殖的关系,并从细胞周期角度探讨其促HSC增殖的机制.方法 采用胆总管结扎(BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型;免疫组织化学方法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;Western blot检测p-FAK(Tyr397)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)在肝组织中的含量.结果 正常大鼠肝组织有少量α-SMA分布,随着肝纤维化发展,α-SMA阳性细胞明显增多;肝组织中p-FAK(Tyr397)、cyclin D1及CDK4蛋白表达逐渐增加,造模4周时达峰值.多元相关分析示α-SMA与p-FAK(Tyr397)正相关(r=0.964,P＜0.01);α-SMA与cyclin D1、CDK4正相关(r=0.953,0.906;P＜0.01);p-FAK(Tyr397)与cyclin D1、CDK4亦明显正相关(r=0.969,0.893;P＜0.01).结论 FAK磷酸化促HSC增殖及肝纤维化形成机制可能与调控细胞周期相关蛋白有关.
关键词： 肝纤维化 肝星状细胞 黏着斑激酶 细胞周期蛋白D1 细胞周期蛋白依赖激酶4 -
黏着斑激酶促进人肺动脉平滑肌细胞增殖
目的 探讨黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是否参与人肺血管平滑肌细胞增殖.方法 将纤黏连蛋白(fibronectin,FN)预处理的培养人肺血管平滑肌细胞进行分组,采用不同浓度的FAK正义寡核苷酸转染,应用免疫沉淀及免疫印迹方法测定FAK的活性及蛋白质表达,并利用MTr比色法及3H-TdR掺入法测定细胞增殖情况.结果 FAK正义寡核苷酸转染后,FAK的活性及蛋白质表达量均随着剂量增加而增加,呈浓度和时间依赖性地促进细胞增殖及3H-TdR掺入.结论 FAK促进人肺动脉平滑肌细胞增殖.
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FAK基因的RNA干扰对肝星状细胞生物活性的影响
目的 探讨靶向黏着斑激酶(FAK)基因的短发卡状RNA(shRNA)对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化与增殖的影响.方法 分别设计2对有小发卡结构的DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组质粒载体,经阳离子聚合物介导转染HSC-T6细胞.通过real-time PCR与Western blot进行筛选鉴定,改良MTr法观察细胞增殖,Westernblot检测HSC活化的标志物α-SMA的表达.结果 shRNA1、shRNA2均能抑制FAK mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中shRNA2对FAK基因抑制率达76.82%,且可明显抑制HSC-T6细胞α-SMA的表达及细胞增殖.结论 靶向FAK基因的shRNA可以抑制HSC-T6细胞的活化与增殖.
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FRNK抑制体外肝星状细胞增殖
目的 用FRNK表达质粒瞬时转染FN诱导的HSCs,探讨FRNK对HSCs增殖的影响.方法 在脂质体介导下用FRNK表达质粒瞬时转染HSCs,用改良的MTT技术测定细胞增殖,用Western blot及RT-PCR技术检测各指标蛋白及mRNA表达.结果 与nFRNK组相比,FRNK在FN诱导的HSCs中大量表达后,于12、24和48 h的增殖抑制率分别为20.07%、26.16%和29.77%(P<0.01);FRNK抑制FAK磷酸化和ERK1、p-ERK的表达,而FN则促进FAK、ERK1和p-ERK表达.结论 在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒,可时间依赖性的抑制HSCs增殖;FAK-ERK信号传导通路可能参与了该过程.
关键词： 肝星状细胞 增殖 黏着斑激酶相关非激酶 黏着斑激酶 细胞外信号调节激酶 -
黏着斑激酶与肿瘤
黏着斑激酶是一种非受体酪氨酸激酶,通过多种信号途径在细胞周期调控、生长调节、黏附、细胞骨架组装、运动、生存等方面发挥重要作用.研究发现,黏着斑激酶在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等.黏着斑激酶已成为当前肿瘤研究热点,有可能成为肿瘤治疗的新靶点.
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黏着斑激酶与纤维化
黏着斑激酶(FAK)是一种非受体胞质酪氨酸蛋白激酶,处于细胞内多条信号传导通路的交汇点,活化后可调节多种细胞生物学行为.研究发现,FAK在多种纤维化疾病的发生发展中发挥重要作用,有可能成为纤维化疾病治疗的新途径.
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Pyk2与肿瘤关系的研究进展
富含脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)是黏着斑激酶家族中的一员.Pyk2参与包括乳腺癌、肝癌在内的多种肿瘤的发生、浸润及转移,并且与肿瘤的预后密切相关.明确Pyk2在肿瘤发生发展中的作用,能为新的抗癌靶向药物的研发提供理论基础.
关键词： 富含脯氨酸蛋白酪氨酸激酶 黏着斑激酶 肿瘤 -
非小细胞肺癌中PTEN和FAK的表达及其临床意义
肺癌发病率高且预后差,新型抑癌基因PTEN和黏着斑激酶(focal adherent kinase,FAK)在肺癌组织中表达的研究较少.本实验研究84例原发性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及相应癌旁组织中两者的表达及临床意义.
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肾性高血压大鼠左心室整合素β1和黏着斑激酶的表达
目的 探讨肾性高血压大鼠左心室壁重构过程中整合素β1(integrin β1)和黏着斑激酶(FAK)的表达变化.方法 采用双侧肾动脉狭窄法制作动物模型,40只SD大鼠随机分为假手术组(sham)、术后2周组、术后5周组和术后7周组,血压及左心室重量指数评价造模成功后,取左心室组织,采用HE染色观察心肌细胞的形态变化,免疫组织化学和Western blotting检测各组左心室肌组织integrin β1和FAK的表达.结果 HE染色结果显示,实验组大鼠左心室组织的心肌纤维走向紊乱,心肌细胞间隙变大;integrin β1和FAK蛋白分别表达于心肌细胞膜和心肌细胞质近膜区,呈线样或细颗粒状分布;integrin β1的表达强度在术后随时间呈逐渐上升趋势,至5周组趋于平稳;FAK在2周组的表达强度相对于假手术组明显下降(P＜0.01),实验组随术后时间增加表达量增强;Western blotting结果显示,integrin β1和FAK在各手术组的表达均明显高于假手术组(P＜0.01),5周组较2周组下降明显(P＜0.01),7周组和5周组差异不明显(P＞0.05).结论 Integrin β1和FAK在心室肌的表达变化可能是高血压心肌肥厚的重要原因.
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黏着斑激酶在急性白血病患者中的表达及其临床意义
目的:观察黏着斑激酶(FAK)在急性白血病(AL)病人白血病细胞中的表达及临床意义.方法:采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测50例AL病人白血病细胞FAK mRNA的表达水平,以10例健康人作为正常对照.收集病人骨髓细胞,用24 h常规培养方法制备染色体,采用R显带技术分析其染色体核型.结果:10名正常人骨髓单个核细胞(MNC)中FAK mRNA阳性表达率为20.0％,50例AL病人白血病细胞FAK mRNA阳性表达率为66.0％,明显高于正常对照组(x2=5.486,P＜0.05);其中急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)病人FAK mRNA阳性表达率和表达水平均高于正常对照组(x2=4.436,P＜0.05;t =7.985、5.595,P＜0.05),但ALL与ANLL二者之间相比无显著性差异(x2=0.0299,P＞0.05;t=2.009,P＞0.05).初诊和复发AL病人白血病细胞FAK mRNA阳性表达率和表达水平均明显升高,二者之间无显著性差异(P=1.000,t=1.010,P＞0.05),但均高于正常对照组(x2=9.38,P=0.015;t=8.789,t=7.5756,P＜0.05).缓解组病人FAKmRNA阳性表达率和表达水平明显降低,均低于初诊组和复发组(x2=10.26,P＜0.05;t =4.4359,t=7.822,P＜0.05),而与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05,t=0.5879,P＞0.05).AL病人FAK mRNA的表达与染色体核型的异常改变具有一定的联系,异常核型检出组的表达率和表达水平明显高于未检出组(x2 =5.82,t =6.72,P＜0.05).结论:FAK mRNA在白血病细胞中表达较高,且与疾病的转归相关,可能为白血病的靶向治疗提供新的位点.
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黏着斑激酶基因沉默靶向治疗白血病的实验研究
本研究旨在探讨黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因沉默对白血病细胞生长、白血病生成及化疗药物敏感性的影响.构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,体外观察细胞生长及凋亡情况.建立白血病动物模型,探讨FAK shRNA对白血病细胞在体内生成的影响.联合应用FAK shRNA及ST1571化疗药物,观察白血病细胞凋亡及动物生存情况.结果显示:成功构建了FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达.体外培养结果表明,FAK基因沉默能抑制白血病细胞生长.凋亡实验发现空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V表达率分别为(3.46±0.56)%和(7.3±0.79)%,两组差异有统计学意义(p＜0.05).白血病动物实验发现,空白对照组小鼠生存时间是21-27天,而FAK基因沉默组小鼠生存时间是52-60天,两组差异有统计学意义(p＜0.05).联合应用FAK基因沉默及ST1571化疗药物表明,两者均能明显促进白血病细胞凋亡并延长动物生存时间.结论:FAK基因沉默能抑制白血病细胞生成,增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略.
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黏着斑激酶和踝蛋白在黏着斑合成代谢中的作用
细胞的运动迁移是一个多因素调控的动态过程,涉及整合素的活化和黏着斑的合成代谢.近年来,有关黏着斑的合成代谢的理论研究取得了实质性进展,且对于黏着斑合成代谢中关键蛋白黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)及踝蛋白(talin)的研究也越来越深入.本文就黏着斑的生物学特性,FAK及 talin在黏着斑合成代谢中的作用展开综述.
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整合素/黏着斑激酶信号转导通路与结直肠癌的侵袭和转移
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,近年来其发病率有逐年上升的趋势.随着肿瘤分子生物学的进展,对结直肠癌分子水平的认识逐步深入.近,细胞内信号转导已成为普遍关注的生物学问题.它调节着多细胞生物的生长、发育、分裂及死亡等生物学行为,并且与结直肠癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关.
