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CO_2气腹对胃癌MKN-45细胞黏着斑激酶的影响
目的 研究CO_2气腹对胃癌MKN-45细胞黏着斑激酶(FAK)的影响.方法 体外模拟不同压力CO_2气腹环境,实验组:人胃癌MKN-45细胞置于5、10、15 mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)CO_2气腹环境培养4 h.对照组:常规条件培养人胃癌MKN-45细胞.采用Western blot法检测各组细胞FAK及磷酸化FAK(FAK Tyr397)的表达量,且分别观察15 mm Hg CO_2作用0.5、2、4 h的情况.多组比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法检验.结果 实验组5、10、15 mm Hg CO_2气腹环境下,FAK表达量分别为2.14±0.17、2.07±0.21、2.52±0.26;FAK Tyr397表达量分别为1.82±0.28、1.93±0.52、3.71±0.37;而对照组FAK表达量为2.43±0.46,FAK Tyr397表达量为1.71±0.23,两组比较差异有统计学意义(F=2.171,26.951,P<0.01).15 mm Hg CO_2作用0.5、2、4 h后,FAK Tyr397表达量分别为3.41±0.44、4.12±0.56、5.24±0.41,三者比较差异有统计学意义(F=116.119,P<0.01).脱离气腹后恢复至处理前水平(0.72±0.16).结论 不同压力CO_2气腹环境处理胃癌MKN-45细胞4 h不增加其FAK表达,但可使其磷酸化而激活,且压力越高,作用时间越长,磷酸化程度越高,但脱离气腹环境后,其活性迅速降至处理前水平.
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雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响及其分子机制
目的 探讨雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响,并初步分析其分子机制.方法 采用含体积分数10％ FBS的RPMI 1640培养液(简称培养液)常规培养HaCaT细胞.(1)取对数生长期细胞,按照随机数字表法将其分为对照组及1、5、50、100、200 nmol/L雷帕霉素组,每组6孔.5个雷帕霉素组细胞分别加入含相应质量浓度雷帕霉素的培养液,对照组细胞加入含二甲基亚砜(DMSO)的培养液.常规培养4h后,采用酶标仪检测细胞增殖活性(以吸光度值表示).(2)取对数生长期细胞,同实验(1)分组培养,每组1孔.常规培养4h后,在活细胞工作站下观察各组细胞3h内运动范围,计算细胞曲线运动速度,筛选雷帕霉素适宜实验浓度.(3)取对数生长期细胞,按随机数字表法将其分为雷帕霉素组和对照组,每组1孔.雷帕霉素组细胞加入含50 nmol/L雷帕霉素的培养液,对照组细胞加入含DMSO的培养液.常规培养4h后行划痕实验,观察划痕后0(即刻)、5、10、15 h的划痕面积并计算后3个时相点的细胞迁移率.(4)取对数生长期细胞,同实验(3)分组培养,每组1孔.用蛋白质印迹法检测细胞黏着斑激酶(FAK)活性(以磷酸化FAK与FAK灰度值比值表示).上述实验重复3次或5次.对数据行单因素方差分析、LSD检验、t检验.结果 (1)对照组及1、5、50、100、200 nmol/L雷帕霉素组细胞增殖活性分别为1.22 ±0.28、1.29 ±0.38、1.12±0.27、1.20±0.29、1.15 ±0.30、1.39 ±0.40,组间比较差异无统计学意义(F=2.112,P=0.068).(2)1、5 nmol/L雷帕霉素组细胞的运动范围与对照组接近,其余3个雷帕霉素组细胞的运动范围明显小于对照组.组间细胞曲线运动速度总体比较,差异有统计学意义(F=3.525,P=0.004).1、5 nmol/L雷帕霉素组细胞曲线运动速度分别为(0.8±0.4)、(0.8±0.8) μm/min,与对照组[(0.9±0.5) μm/min]相近(P值均大于0.05);50、100、200 nmoL/L雷帕霉素组细胞曲线运动速度分别为(0.7±0.5)、(0.7±0.4)、(0.7±0.4)μm/min,明显慢于对照组(P值均小于0.01).选择50 nmol/L雷帕霉素用于后续实验.(3)划痕后0、5h,雷帕霉素组细胞划痕面积与对照组相近;划痕后10、15h,雷帕霉素组细胞划痕面积较对照组大.划痕后5h,对照组及雷帕霉素组的细胞迁移率分别为(17.5±2.6)％、(15.8±3.5)％,组间比较差异无统计学意义(t=1.951,P＞0.05).雷帕霉素组划痕后10、15 h的细胞迁移率分别为(42.5±4.0)％、(71.3±9.2)％,明显低于对照组的(46.9±6.7)％、(88.0±7.7)％,t值分别为2.732、6.746,P值均小于0.01.(4)雷帕霉素组细胞FAK活性为0.16 ±0.08,明显低于对照组的0.46±0.14,t=4.967,P＜0.01.结论 在HaCaT细胞中,FAK信号通路对雷帕霉素敏感,FAK活性下降可能参与介导雷帕霉素对HaCaT细胞迁移的抑制效应.
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肾综合征出血热循环内皮细胞中黏着斑激酶及热休克蛋白70表达的研究
目的 通过检测肾综合征出血热(HFRS)患者循环内皮细胞(CEC)计数及CEC中磷酸化黏着斑激酶(FAKps910)、热休克蛋白70 (HSP70)的阳性表达率,了解HFRS患者CEC计数及FAKps910、HSP70表达的动态变化,探讨其临床意义.方法 50例HFRS患者按病情分为轻型17例、中型20例、重型及危重型13例,健康对照组20例.流式细胞技术检测CEC计数及CEC中FAKps910、HSP70的表达情况.结果 从发热早期至多尿期,HFRS患者CEC计数[发热早期:(13.37±5.19)个/μl；发热期末或低血压休克期:(47.73±19.89)个/μl；少尿期(41.11±16.21)个/μl；多尿期(19.29±4.81)个/μl]及HSP70的表达水平(发热早期:53.26％±10.54％；发热期末或低血压休克期:56.21％±8.83％；少尿期:40.13％±6.99％；多尿期:28.53％±6.79％)均显著高于对照组[CEC计数:(3.31±1.49)个/μl；HSP70:23.89％±4.70％],至恢复期[CEC计数:(3.86±1.98)个/μl；HSP70:26.52％±6.31％]则逐渐趋向正常.在发热期末或低血压休克期CEC及HSP70随病情加重而升高,在重型和危重型患者中达到高峰.但循环内皮细胞中FAKps910的表达水平在发热早期(59.87％±9.58％)明显升高,发热期末或低血压休克期降至正常水平以下(11.64％±2.17％),以后又恢复正常(少尿期:22.44％±4.09％；多尿期:21.05％±2.61％;恢复期:20.94％±3.15％).且发热末或低血压期FAKps910的表达随病情加重而减少,在重型和危重型患者中降至低.结论 HFRS中CEC计数明显增高并能反映内皮细胞损伤的程度,FAKps910、HSP70在病程中规律性变化,提示黏着斑(FAK)可能与汉坦病毒引起的整合素β3介导的血管内皮细胞损伤有关；而HFRS患者的CEC中HSP70表达增高,可能对CEC具有保护作用.CEC计数、FAKps910及HSP70还可作为早期病情的预测指标.
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小鼠皮肤切创黏着斑激酶和磷酸化黏着斑激酶的表达及其变化规律
目的 研究小鼠皮肤切创愈合过程中,黏着斑激酶(focal adhesion kinase.FAK)和磷酸化黏着斑激酶(pllospho-FAK,p-FAK)在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律. 方法 应用免疫组织化学染色技术和免疫印迹(westem blot)方法观察小鼠背部切创后损伤区及损伤周边区FAK及p-FAK的表达情况. 结果 伤后3 h,FAK和p-FAK主要表达于多核粒细胞;伤后6～24h,主要表达于大部分浸润的多核粒细胞和单核细胞;伤后3～14d.主要表达于单核细胞和成纤维细胞.伤后FAK的阳性细胞率逐渐增高,于3d达到高峰,随后迅速下降;伤后p-FAK的阳性细胞率也逐渐增加,于12h达到高峰,之后逐渐下降.Western blot结果显示.正常皮肤中FAK及P>-FAK均有表达.FAK表达强度变化不是十分明显,但仍可见在3d时含量达到高.p-FAK蛋白含量伤后逐渐增加,12h表达强,随后逐渐下降.结论 在小鼠皮肤切创愈合过程中,FAK和p-FAK阳性细胞率呈时间规律性变化,可用于皮肤切创损伤时间的推断.p-FAK呈现出明显的时间规律性变化,说明作为皮肤损伤时间的推断指标要优于FAK.
