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用HaCaT细胞和正常人黑素细胞构建组织工程皮肤
目的 探索用人永生化表皮细胞(HacaT)和黑素细胞复合鼠尾胶原凝胶支架构建组织工程皮肤的可行性.方法 HaCaT细胞和黑素细胞与鼠尾胶原复合,经历液下和气液面共13 d的培养,苏木素-伊红(HE)染色观察不同培养阶段组织学形态变化,S-100免疫组化染色观察黑素细胞分布情况.结果 随培养时间的延长,组织工程皮肤的细胞层数逐渐增加,结束时可达12～15层;同时,细胞层内发生黑素化,颜色逐渐加深,组织学结构可见黑素颗粒分布广泛,S-100免疫组化染色显示黑素细胞均匀分布于基底层.结论 在鼠尾胶原凝胶支架表面用HaCaT细胞和黑素细胞可构建出组织工程皮肤,为探索基于组织工程皮肤的化合物光毒性检测奠定基础.
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姜黄素对纳米二氧化硅诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用
目的 研究姜黄素对纳米二氧化硅诱导HaCaT细胞损伤的保护作用.方法 建立15-nm二氧化硅致HaCaT细胞损伤的体外研究模型,通过CCK-8法检测细胞活力水平;测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量和细胞内丙二醛(MDA)含量,评价细胞的损伤程度.结果 姜黄素能明显改善15-nm二氧化硅诱导HaCaT细胞的损伤,与二氧化硅组相比,姜黄素干预组能提高细胞存活率,细胞培养液中的LDH漏出量明显减少(P＜0.05),细胞内的MDA明显降低(P＜0.05).结论 姜黄素对15-nm二氧化硅诱导的HaCaT的细胞损伤具有一定的保护作用.
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纳米二氧化硅对HaCaT细胞中p53基因表达及其启动子甲基化的影响
目的 研究纳米二氧化硅(nm-SiO2)对人皮肤表皮细胞(HaCaT)中p53基因的表达及基因启动子区甲基化的影响.方法 分别以2.5、5、10 μg/ml的nm-SiO2溶液和10 μg/ml的微米级SiO2(micro-SiO2)处理HaCaT 24 h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理48 h的10 tμg/ml nm-SiO2组为阳性对照,并设立溶剂对照组.应用荧光定量PCR检测p53基因mRNA水平的表达,Western-blot法检测其蛋白水平的变化,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测p53基因启动子区CpG岛的甲基化状态.结果 nm-SiO2作用24 h后,HaCaT细胞中p53基因表达呈上调趋势并且p53启动子区未检测出甲基化状态.结论 nm-SiO2暴露可以上调HaCaT细胞中p53基因的表达,尚未发现这种上调与p53基因启动子区CpG岛的甲基化水平改变有关.
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HSF1/HSP70通路抑制c-Jun氨基末端激酶的活化保护UVA诱导的HaCaT细胞凋亡
目的 观察热休克转录因子1( HSF1)与热休克蛋白70( HSP70)对紫外线A(UVA)诱导HaCaT细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 建立8mJ/cm2 UVA辐射损伤HaCaT细胞的病理模型.将细胞随机分为对照组、8mJ/cm2 UVA照射组、HSP70转录抑制剂组(50 μmol/L槲皮素).Honechst 33258荧光染色观察细胞凋亡；蛋白质印迹法检测UVA辐射HaCaT细胞后p-HSF1和HSP70蛋白的经时变化及UVA辐射后孵育6h JNK(c-Jun氨基末端激酶)、p-JNK的蛋白表达；Real-Time PCR检测HSP70 mRNA的表达.结果 UVA辐射后HaCaT细胞内p-HSF1、HSP70蛋白表达量均出现先增加后减少的时间依赖性趋势,其中p-HSF1于lh开始增加,3h达高峰,HSP70于6h达高峰,24h基本恢复原始水平；UVA辐射前预先加入HSP70转录抑制剂槲皮素能显著抑制HSP70 mRNA的表达,增加p-JNK的表达量,同时Honechst 33258荧光染色观察其与UVA辐射组比较凋亡率明显升高.结论 8mJ/cm2 UVA辐射HaCaT细胞在一定时间内可使HSF1活化致HSP70表达增加.HSFl/HSP70通路对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡具有保护作用,其机制与HSP70大量表达后抑制JNK的活化有关.
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活性氧、丙二醛及超氧化物歧化酶在NaAsO2致人角质形成细胞恶性转化过程中的动态变化
目的 探讨氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)在砷致人角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaT)恶性转化不同阶段的动态变化.方法 以含1.0 μmol/L NaAsO2的DMEM高糖完全培养基连续培养HaCaT细胞35代后,用基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平变化、细胞生长动力学改变和软琼脂集落形成实验鉴定其是否发生恶性转化.分别收集0、1、7、14、21、28和35代细胞,采用流式细胞仪检测不同代数细胞内ROS活性,生化法检测细胞内MDA含量及SOD活性变化.结果 1.0μmol/L NaAsO2处理HaCaT细胞28代开始MMP-9相对蛋白水平明显上升,35代后细胞生长速度明显增快,倍增时间明显缩短;软琼脂集落形成数为(107±11)个,较对照组(24±7)明显增多(P＜0.01).ROS水平在染毒0到14代间呈先上升后下降随后再上升趋势,14代以后ROS水平逐渐降低.MDA含量在染毒1代时达到峰值,随后呈缓慢下降趋势.SOD活性在染毒0到21代呈先上升后缓慢下降趋势,21代以后其活性再次升高,呈持续上升趋势,且较0代明显升高(P＜0.05).结论 低剂量亚砷酸钠长期诱导HaCaT细胞发生恶性转化过程中伴随细胞内氧化-抗氧化平衡失调,染毒后期SOD活性持续增加而ROS水平持续降低.
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清热活血解毒复方对体外培养HaCaT细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察中药清热活血解毒复方对人永生化角质形成细胞株(HaCaT)增殖、凋亡和细胞周期的影响,探讨其治疗银屑病可能的作用机制.方法 将不同浓度的清热活血解毒复方水提物分别作用于体外培养的HaCaT细胞,采用CCK-8法检测药物对细胞增殖的抑制作用及药物的有效浓度;采用倒置显微镜观察药物处理前后细胞的形态学改变;流式细胞术检测细胞周期的变化及凋亡率.结果 清热活血解毒复方以时间和浓度依赖性方式抑制HaCaT细胞增殖,作用24、48 h其半抑制浓度(IC50)分别为23.40、20.24 mg/mL.细胞形态学和流式细胞仪检测发现药物以浓度依赖性方式干扰细胞周期,诱导细胞凋亡,细胞分裂周期阻滞于G0/G1期.结论清热活血解毒复方可能通过抑制HaCaT细胞增殖、诱导凋亡、影响细胞周期而发挥治疗银屑病的作用.
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花椒油对HaCaT细胞膜流动性及膜电位的影响及其机制研究
目的:本文选择HaCaT角质形成细胞测定花椒挥发油对其细胞膜流动性和膜电位的影响及其机制,研究花椒挥发油对皮肤活性表皮的影响,探讨其促进药物透皮吸收的作用机制.方法:采用CCK-8试验测定花椒挥发油的细胞毒性,利用荧光漂白恢复技术(FRAP)考察不同浓度花椒挥发油对细胞膜流动性的影响,采用流式细胞仪测定不同浓度花椒挥发油对细胞膜电位的改变,同时考察了花椒挥发油对HaCaT细胞内Ca2+浓度的影响,采用超微量Ca2+-ATP酶试剂盒测定花椒挥发油对HaCaT细胞内Ca2+-ATP酶活性的影响.结果:相对于常用化学促透剂氮酮,花椒挥发油具有较低细胞毒性,花椒挥发油可增加HaCaT细胞膜流动性、降低细胞膜电位,同时可降低Ca2+-ATP酶活性、增加HaCaT细胞内Ca>浓度而影响细胞Ca2+平衡.结论:花椒挥发油可能通过改变细胞内Ca2+平衡而影响细胞膜流动性及膜电位,增加活性表皮流动性以降低皮肤表皮屏障作用,从而利于药物的透皮吸收.
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丹皮酚对Hacat细胞增殖及凋亡的影响
目的:明确丹皮酚对Hacat细胞增殖及凋亡的影响.方法:培养人角质形成细胞株Hacat,采用WST-8检测细胞丹皮酚对Hacat细胞增殖的影响;流式细胞仪检测丹皮酚对Hacat细胞细胞周期及凋亡的影响.结果:丹皮酚能有效抑制Hacat细胞的增殖,将Hacat细胞阻滞于G2/M期,同时丹皮酚可有促进Hacat细胞凋亡作用.结论:丹皮酚可抑制角质形成细胞的增殖,促进角质形成细胞的凋亡,可能是牡丹皮治疗银屑病的有效单体之一.
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中药清热利湿饮对HaCaT细胞增殖及凋亡的影响
目的:探讨中药清热利湿饮水提液对经肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导活化的人永生化角质形成细胞(HaCaT)增殖及凋亡的影响.方法:采用MTT法检测清热利湿饮提取液对HaCaT细胞增殖的影响,采用流式细胞仪技术检测HaCaT细胞的凋亡.结果:25.00、50.00、100.00g/L清热利湿饮对经TNF-α诱导的HaCaT细胞均有明显的增殖抑制作用,与MTX阳性对照组相比,差异显著(P＜0.05,P＜0.01).10.00g/L和12.50g/L清热利湿饮作用于活化后的HaCaT细胞,凋亡率为(44.94±4.16)％和(45.75±4.74)％,与MTX组(37.12±5.44)％相比有显著性差异(P＜0.05).结论:清热利湿饮可通过诱导细胞凋亡而抑制HaCaT细胞的过度增殖.
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紫草素抑制表皮生长因子促HaCaT细胞增殖的机制
目的:研究紫草素抑制表皮生长因子(EGF)促HaCaT细胞增殖的机制及miR-21在其中的可能作用.方法:MTT法检测EGF、紫草素、miR-21模拟剂及miR-21抑制剂对HaCaT细胞增殖的影响;Western Blot法检测紫草素、EGF、miR-21模拟剂及miR-21抑制剂对HaCaT细胞PCNA表达的影响.结果:EGF浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖:紫草素浓度依赖性抑制HaCaT细胞增殖;miR-21抑制剂、紫草素抑制EGF对HaCaT细胞的促增殖作用以及PCNA蛋白表达的上调作用,EGF、miR-21模拟剂部分逆转紫草素抑制HaCaT细胞增殖的作用以及对HaCaT细胞PCNA蛋白表达的下调作用.结论:紫草素可明显抑制EGF对HaCaT细胞的促增殖作用,其机制可能为通过抑制miR-21的表达,达到抑制HaCaT细胞增殖的作用.
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熊果酸对Hacat细胞增殖及凋亡的影响
目的:观察中药白花蛇舌草主要有效单体熊果酸对人永生化细胞株Hacat细胞增殖及凋亡的影响,明确百花蛇舌草治疗银屑病的机制.方法:体外培养人角质形成细胞株Hacat,使用WST-8法检测熊果酸对Hacat细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测熊果酸对Hacat细胞细胞周期及凋亡的影响,并采用免疫荧光染色的方法标记凋亡细胞,从而进一步验证熊果酸对Hacat细胞凋亡的影响.结果:熊果酸能有效抑制Hacat细胞的增殖,与药物浓度呈正相关,同时可以将Hacat细胞阻滞于G1/G0期,同时可促进Hacat细胞凋亡.结论:熊果酸对角质形成细胞增殖有抑制作用,角质形成细胞凋亡有促进作用,推断其可能是白花蛇舌草治疗银屑病的有效单体之一.
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冰片对HaCaT细胞膜流动性及膜电位的影响
目的：研究冰片对皮肤活性表皮作用方式，探究冰片作为经皮促透剂的促透作用机制。方法选择常用经典化学经皮促透剂氮酮作为阳性对照促透剂，采用CCK-8试剂盒测定并计算冰片对HaCaT细胞的半数抑制率(IC50)，利用荧光漂白恢复技术测定不同浓度冰片对HaCaT细胞膜流动性的影响，采用流式细胞仪测定冰片对HaCaT细胞膜电位及细胞膜内Ca2+浓度的影响。结果冰片和氮酮的药物IC50分别为2.826、0.172 mmol/L；冰片可增加HaCaT细胞膜流动性，且随着药物浓度的增大而增加，呈剂量依赖性关系；冰片可降低HaCaT细胞膜电位和HaCaT细胞内Ca2+浓度，表现出类似氮酮作用特点。结论冰片的经皮促透作用机制可能与其影响角质细胞内Ca2+浓度进而改变活性表皮角质形成细胞膜电位和膜流动性有关。
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蜈蚣败毒饮药物血清对银屑病HaCaT细胞凋亡相关基因表达的影响
目的：探讨蜈蚣败毒饮对银屑病HaCaT细胞凋亡相关基因Bcl-2、核因子-κB(NF-κB)mRNA表达的影响。方法实验大鼠随机分为空白对照组、西药对照组、中药对照组和蜈蚣败毒饮低、中、高剂量组，分别给予生理盐水、甲氨蝶呤混悬液、复方青黛胶囊混悬液和蜈蚣败毒饮低、中、高剂量浓缩液灌胃，制备相应的药物血清，将其分别作用于HaCaT细胞中培养传代，采用RT-PCR法检测不同药物血清对目的基因表达的干预作用。结果各组药物血清均能够降低HaCaT细胞Bcl-2、NF-κB mRNA的表达，蜈蚣败毒饮高剂量组和西药对照组的作用效果为明显，且蜈蚣败毒饮各剂量组呈现出一定的量效关系。结论蜈蚣败毒饮可能通过降低Bcl-2、NF-κB mRNA的表达促进了HaCaT细胞凋亡，调控T细胞相关因子降低免疫反应，从而发挥抗银屑病样的作用。
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紫草素对IL-17诱导角质形成细胞增殖及趋化因子表达的影响
目的:观察紫草素(shikonin)对IL-17诱导人角质形成细胞增殖及其分泌趋化因子的影响,探讨紫草素治疗银屑病的作用机制.方法:采用IL-17A(200 μg· L-1)刺激体外培养的HaCaT细胞,同时加入不同浓度紫草素(2,1mg·L-1)共同作用24h.CCK-8法测定细胞增殖;ELISA法测定细胞分泌炎症因子IL-23;Real-time PCR法测定细胞内趋化因子CXCL1,CXCL2和CCL20以及β-防御素4(β-defensin4,DEFB4)的表达.结果:紫草素2,1 mg· L-1能显著抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖,具有统计学意义(P＜0.01);紫草素各浓度组均能减少IL-23分泌,并对细胞内CXCL1,CXCL2,CCL20和DEFB4的表达有一定的抑制作用.结论:紫草素能抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖和相关细胞因子的分泌,并可以通过抑制趋化因子募集白细胞,从而达到对银屑病的治疗作用.
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萜烯类经皮促透剂对皮肤活性表皮层的影响及其机制研究
该文选择HaCaT皮肤角质形成细胞测定萜烯类经皮促透剂对皮肤活性表皮层的影响,探讨其促进药物透皮吸收的作用机制.选择具良好经皮促透效果的萜烯类化合物,即薄荷醇、柠檬烯、1,8-桉树脑、薄荷酮、4-萜品醇和长叶薄荷酮;采用MTr试验测定萜烯类经皮促透剂的细胞毒性,利用荧光漂白恢复技术(FRAP)考察不同萜烯类促透剂对细胞膜流动性的影响,采用流式细胞仪测定不同萜烯类促透剂对细胞膜电位的改变,同时考察了萜烯类促透剂对HaCaT细胞内Ca2+浓度的影响,采用超微量Ca2+-ATP酶试剂盒测定萜烯促透剂对HaCaT细胞内Ca2+-ATP酶活性的影响.实验结果表明,相对于常用化学促透剂氮酮,6种萜烯类促透剂均显示较低细胞毒性;所选择的萜烯类促透剂可显著增加HaCaT细胞膜流动性、降低细胞膜电位,同时可降低HaCaT细胞Ca2+-ATP酶活性和细胞内Ca2+浓度而影响细胞Ca2平衡.因此,萜烯类促透剂可能通过改变细胞内Ca2平衡而影响细胞膜流动性及膜电位,增加皮肤活性表皮流动性而降低皮肤屏障作用,从而利于药物的透皮吸收.
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槲皮素对HaCat细胞增殖及β-防御素和谷胱甘肽过氧化物酶表达的影响
目的 研究槲皮素(quercetin)对人永生化上皮细胞(HaCat细胞)增殖及其非特异性免疫分子表达的影响.方法 利用MTT法检测不同浓度槲皮素溶液作用对HaCat细胞增殖的影响,利用ELISA法检测在不同浓度槲皮素干预下的HaCat细胞培养上清液中β-防御素(β-DF)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的含量. 结果 100 μmol/L槲皮素对HaCat细胞的增殖有抑制作用,50 μmol/L以下的槲皮素对HaCat细胞的增殖无明显影响.HaCat细胞经过不同浓度的槲皮素处理48、72 h后,其细胞上清液中谷胱甘肽过氧化物酶的浓度与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),但β-防御素的表达在50.00 μmol/L和25.00 μmol/L槲皮素处理组上调. 结论 槲皮素具有增强细胞非特异免疫功能作用,其机制可能通过上调β-防御素的表达来实现.
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紫草素对IL-17刺激HaCaT细胞分泌VEGF影响的研究
目的 观察白细胞介素-17(IL-17)对HaCaT细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响及紫草素的干预作用。方法 收集IL-17刺激组和紫草素处理后HaCaT细胞及其培养土清，分别用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)及实时荧光免疫定量-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测VEGF含量。应用细胞计数盒-8(CCK-8)检测各组HaCaT细胞活力。结果 与对照组相比，不同时间IL-17刺激组HaCaT细胞及其培养上清中VEGF表达均高于对照组(P＜0.001)；紫草素处理组HaCaT细胞及其培养上清VEGF表达均低于IL-17处理组(P＜0.001)；与对照组比较，CCK-8检测各组HaCaT细胞活力无明显差异(P＞0.05)。结论 IL-17可促进HaCaT细胞分泌VEGF，呈时间依赖型，而紫草素对其具有抑制作用。
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咪喹莫特对朗格汉斯细胞及角质形成细胞细胞因子mRNA表达及分泌水平的影响
目的观察咪喹莫特(Imiquimod)溶液对人表皮朗格汉斯细胞(LC)及永生化角质形成细胞(KC)株-HaCaT细胞细胞因子mRNA及分泌水平的影响,探讨其免疫调节机制.方法联用密度梯度离心及免疫磁珠法分离纯化人表皮LC,将LC及HaCaT细胞均各分为实验组和对照组,实验组加5 μg/ml咪喹莫特,对照组不加药,处理4 h后,提取总RNA,采用RT-PCR法分别检测各组细胞中细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表达量,取培养上清,用ELISA方法检测3种细胞因子的含量.结果 LC实验组TNF-α、IL-1β及IL-6 3种细胞因子mRNA表达量及分泌量均较对照组显著增高(P＜0.05),而HaCaT细胞组加药后3种细胞因子mRNA表达量及分泌量较对照组未见明显增加(P＞0.05).结论 5μg-/ml咪喹莫特溶液能增加LC细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表达量,但其对HaCaTT细胞上述3种细胞因子mRNA表达量均未见有明显上调作用.
关键词： 咪喹莫特 朗格汉斯细胞(LC) 角质形成细胞(KC) HaCaT细胞 细胞因子 RTPCR -
复方甘草酸苷对 T 细胞相关细胞因子的影响
目的：观察银屑病外周血单一核细胞（PBMCs）培养上清液对角质形成细胞株 HaCaT细胞的增殖作用及复方甘草酸苷（CG）对 HaCaT 细胞分泌 IL-2、IL-4的影响，探讨银屑病的发病机制与 CG 治疗银屑病的作用机制。方法采用噻唑蓝（MTT）方法检测银屑病患者（银屑病组）及正常人（正常对照组）PBMCs 培养上清液作用于 HaCaT 细胞后的增殖变化；分为四组：空白对照组，50μl/ml 组、100μl/ml 组、200μl/ml 组，不同浓度 CG 作用于 HaCaT 细胞24 h，双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）分析 CG 处理后的 HaCaT 细胞上清液 IL-2及 IL-4的表达。结果银屑病组对HaCaT 细胞的促增殖作用较正常对照组显著增强（P＜0.05）。100μl/ml CG 组与200μl/ml CG 组培养上清液中 IL-2浓度较空白对照组均明显下降（均 P＜0.01），并且加药组组间两两比较 IL-2浓度差异均有统计学意义（均 P＜0.05）；200μl/ml CG 组培养上清液中 IL-4的浓度较空白对照组明显升高（P＜0.05）。结论银屑病患者 PBMCs 培养上清液具有促进皮肤角质形成细胞增殖的特性；复方甘草酸苷的抗炎作用可能是通过调节细胞因子 IL-2与 IL-4的分泌而实现的。
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稳定表达人乳头瘤病毒16型E7癌基因HaCaT细胞系的建立及其研究
官颈癌是世界第二大妇女常见肿瘤[1].大量流行病学和分子生物学研究证实高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV),尤其是HPV16型在宫颈癌发生、发展进程中起关键作用[2-3].HPV16型E7基因编码蛋白与细胞转化和病毒复制的调控有关,在维持转化组织恶性表型的过程中发挥重要作用.本研究选择与官颈卜皮细胞相似的非肿瘤性人永生化表皮细胞(HaCaT)作为研究对象,通过真核表达载体pCMV将HPVl6 E7基因导人HaCaT细胞,使HPV16 E7在HaCaT细胞中表达,探讨其对HaCaT细胞的增殖、周期及HLA-Ⅰ类分子表达的影响.
