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针刀对膝骨性关节炎兔软骨细胞外基质Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖相关蛋白表达的影响
目的:观察针刀对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)兔软骨细胞外基质Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)相关蛋白表达的影响,探讨针刀治疗KOA的相关机制.方法:新西兰兔随机分为空白组、模型组、针刀组和电针组,每组10只,以左后肢伸直位固定制动法制备KOA模型.针刀组以膝关节内、外侧副韧带及髌韧带为松解对象,以纵疏横剥法进行针刀松解,每周1次,共治疗3周;电针组电针左后肢“阴陵泉”“阳陵泉”“内膝眼”“外膝眼”,每次20 min,每周治疗3次,共3周.X线观察膝关节影像学改变,光镜观察关节软骨形态学改变,Western blot法分别检测膝关节整合素β 1(Integrin β 1)、Col-Ⅱ、基质金属蛋白酶3(MMP-3)及Aggrecan的蛋白表达水平.结果:X线结果显示,造模后,模型制备成功,关节病损情况属于早中期膝骨关节炎.光镜结果显示,模型组关节软骨层表面粗糙不平,表层软骨细胞稀少,细胞排列紊乱,部分软骨细胞坏死,潮线模糊或扭曲不完整,部分软骨有血管通过或血管翳生成,电针组及针刀组关节软骨组织结构均较模型组明显改善,针刀组较电针组改善更明显.Mankin评分比较,模型组较空白组明显升高(P＜0.01),针刀组较模型组明显降低(P＜0.01).Western blot结果显示,模型组膝关节组织中Integrin β 1、Col-Ⅱ、Aggrecan蛋白表达较空白组显著降低(P＜0.01),MMP-3蛋白表达显著升高(P＜0.01);针刀组Integrin β 1、Col-Ⅱ、Aggrecan蛋白表达较模型组显著升高(P＜0.01,P＜0.05),MMP-3蛋白表达较模型组显著降低(P＜0.01);电针组Integrin β 1蛋白表达较模型组明显升高(P＜0.05),其它指标与模型组的差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:针刀可能通过对软骨力学环境的影响,激活整合素力学信号转导通路,促进细胞外基质Col-Ⅱ、Aggrecan蛋白表达,下调MMP-3的蛋白表达水平,阻抑软骨细胞外基质的降解,延缓软骨损伤与关节退变程度,达到治疗KOA的目的.
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针刀对膝骨关节炎兔软骨细胞磷酸化黏着斑激酶 、磷酯酰肌醇-3激酶 、聚集蛋白聚糖基因及蛋白表达的影响
目的:观察针刀对膝骨关节炎(KOA)兔关节软骨磷酸化黏着斑激酶(p-FAK)、磷酸化磷酯酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因和蛋白表达的影响,探讨针刀干预促进软骨细胞修复的可能力学转导通路.方法:新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、模型抑制剂组、针刀组、针刀抑制剂组、电针组、电针抑制剂组,每组7只.采用改良Videman左后肢伸直位固定制动法复制KOA模型.电针组、电针抑制剂组电针左侧"梁门""血海""内膝眼""外膝眼",每周3次,治疗4周.针刀组、针刀抑制剂组分别采用针刀治疗,每周2次,治疗4周.采用Real-time PCR法和Western blot法检测各组家兔膝关节软骨p-FAK、p-PI3K、Aggrecan基因和蛋白表达水平.结果:与正常组相比,模型组p-FAK、p-PI3K mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),Aggrecan mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.01).与模型组比较,电针组p-FAK、p-PI3K、Aggrecan蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),针刀组p-FAK、p-PI3K、Aggrecan mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01).与电针组相比,针刀组p-FAK蛋白及p-PI3K、Aggrecan mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01).与相同干预方法组相比,模型抑制剂组(除p-PI3K mRNA外)、电针抑制剂组、针刀抑制剂组p-FAK、p-PI3K、Aggrecan mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.05,P<0.01).结论:FAK-PI3K信号通路在针刀干预后关节软骨的修复过程中起到了重要的介导作用.
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不同力学刺激对软骨基质代谢的影响
软骨基质的代谢反应可以显著地影响关节软骨的生物力学功能.力学刺激导致问质金属蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制剂及软骨聚集蛋白聚糖酶之间的失衡,研究力学刺激对软骨基质代谢的影响不仅有利于阐明生物力学因素在骨性关节炎发病机制中的作用,而且为软骨组织工程中相关力学因素的研究提供了新的思路与技术方法,为终利用组织工程治疗软骨损伤提供相关理论依据.笔者就力学刺激对软骨基质代谢的影响作一综述.
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结缔组织生长因子在椎间盘退行性病变过程中的机制研究
1结缔组织生长因子（CTGF）的结构域和功能：CCN 家族由6名成员组成，每个家族成员都包含4个保守的功能域。每个功能域能够独立性和合作性的发挥CCN 家族成员的整体功能。胰岛素样生长因子结合蛋白功能域和von Wille-brand 因子C（von Wille-brand factor C VWC）同时被绑定到聚集蛋白聚糖。VWC 域还结合骨形态发生蛋白和转化生长因子β，整合素和基质金属蛋白酶。
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人髓核软骨样细胞的生物学特性观察
目的:探讨人髓核软骨样细胞的生物学特性,为组织工程椎间盘种子细胞的选取提供依据.方法:髓核组织取材于3例脊柱侧凸行前路矫形手术者(年龄11～13岁),依次用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶分离髓核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的F12培养液培养细胞,取传1～7代次细胞进行光镜、电镜检查,观察细胞形态学改变,对细胞计数、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)摄取进行比较,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白信使RNA(mRNA)的表达情况.结果:体外培养条件下,传3代之前的细胞形态正常,胞浆丰富;传4代起.部分细胞的形态逐渐向长梭形演化.与传1代细胞相比,传2、3代细胞数量增殖无明显减缓(P>0.05),传4代细胞第4天开始生长减慢(P<0.05),传5Ⅰ7代细胞第2天即较转1代细胞数量明显减少(P<0.05).传1Ⅰ3代细胞的MTT摄取吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),和传1代相比,传4代具有统计学差异(P<0.05),传5Ⅰ7代的差异更显著(P<0.01).聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原在传3代之前各代次的mRNA表达量间无统计学差异(P>0.05),和传1代相比,Ⅱ型胶原从第4代起表达量显著下降(P<0.05),聚集蛋白聚糖从第5代起表达量显著下降(P<0.05),而从传5代起髓核软骨样细胞开始表达Ⅰ型胶原:结论:髓核细胞传代后前3代细胞形态良好,增殖能力强,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达良好,适合作为组织工程椎间盘的种子细胞.
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聚集蛋白聚糖基因多态性与腰椎间盘退变相关性的研究进展
椎间盘退变是导致腰背痛的重要原因,其病因学复杂,以往人们多将其归因于环境因素[1],近年来一系列研究认为遗传因素可能在退变过程中发挥了更大的作用[2、3].聚集蛋白聚糖基因第12个外显子上存在可变数目串联重复片段(VNTR)多态性,不同的等位基因可能在遗传和分子水平上决定了聚集蛋白聚糖的表达量和功能特征[4].由于聚集蛋白聚糖是椎间盘髓核细胞外基质的重要成分,退变性椎间盘疾病又常表现出聚集蛋白聚糖含量的变化[5],故近年来不少学者开始研究聚集蛋白聚糖基因VNTR多态性与腰椎间盘退变之间的关系,笔者在此对其研究进展做一综述.
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聚集蛋白聚糖与椎间盘退变的研究进展
椎间盘退行性变是椎间盘突出症、椎体滑脱、椎管狭窄等脊柱退行性病变的首要诱因.椎间盘组织具有以基质为主要结构,细胞散在分布于基质内的结构特点.蛋白聚糖和胶原是椎间盘基质内主要的蛋白质,对于基质结构和功能的完整性不可或缺,因而它们的损耗是椎间盘退变中的重要环节.聚集蛋白聚糖(Aggrecan)是椎间盘蛋白聚糖中主要的一种;基质内Aggrecan的损耗(质、量的下降)是椎间盘退变的首要早期改变,也是治疗椎间盘退变时必须改善的部分.笔者着重就Aggrecan损耗的机制、后果以及改善Aggrecan损耗的措施等研究进展作一综述.
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T140靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响
目的:明确T140体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响,探讨T140减缓软骨退变的作用.方法:健康9月龄雄性Hartley豚鼠36只,随机分成A、B、C三组,A组为实验组,B组为实验对照组,C组为空白对照组,每组12只.于12周时,获取膝关节软骨,采用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)及聚集蛋白聚糖mRNA的表达;Western blot检测ColⅡ含量.结果:RT-PCR检测结果显示A组Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的mRNA表达量高于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blot检测结果发现A组ColⅡ含量高于B、C组(P＜0.05).结论:T140于体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路,减少关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解,进而减缓关节软骨的退变.
关键词： T140 SDF-1/CRCR4信号通路 Ⅱ型胶原蛋白 聚集蛋白聚糖 -
聚集蛋白聚糖基因多态性与腰椎间盘突出症的关联性
背景:课题组以往研究表明,中国南方地区汉族人群聚集蛋白聚糖基因存在串联重复序列多态性.目的:观察聚集蛋白聚糖基因多态性与腰椎间盘突出症的关联性.方法:纳入椎间盘突出症患者和非椎间盘突出症患者各51 例.应用聚合酶链反应检测两组聚集蛋白聚糖基因多态性分布情况.采用分层χ2 检验分析聚集蛋白聚糖基因多态性在非椎间盘突出症组合腰椎间盘突出症组之间的分布差异.结果与结论:两组聚集蛋白聚糖基因多态性分布情况检测发现,聚集蛋白聚糖等位基因分布以中等长度串联重复序列片段多见,短和长串联重复序列片段较少见,两组中出现频率多的基因型是等位基因27,两组聚集蛋白聚糖等位基因多态性频率分布差异无显著性意义(P > 0.05).在基因型的分布上两组变化趋势基本相同,非椎间盘突出症患者和椎间盘突出症患者分别得出7 和6 种长短不同的串联重复序列.结果证实,聚集蛋白聚糖基因多态性与腰椎间盘突出症尚无明确关联.
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Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞
背景：椎间盘为负重却缺乏血运的组织，在体外培养过程中存在表型丢失问题，因而容易发生退行性改变，但椎间盘退变的机制尚不明确。
目的：探讨兔髓核细胞分离、贴壁培养、扩增和鉴定的方法，并观察髓核细胞在不同代次的生长特性。
方法：应用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合的方法，分离、纯化髓核细胞并进行体外扩增，用倒置显微镜观察各代细胞的形态、生长状况，计数细胞数量，并绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红染色后光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学方法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达情况，并进行细胞鉴定。
结果与结论：成功的实现了兔髓核细胞体外分离、培养及扩增。生长特性观察发现，髓核细胞第1-3代细胞增殖能力强，活力旺盛，但随着传代次数的增加，细胞增殖能力程逐渐下降的趋势。分离培养的髓核细胞阳性表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。体外采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合，可获得高纯度的髓核细胞，培养的髓核细胞呈类圆形或多角形生长，第1-3代细胞生长活性较强。 -
胰岛素样生长因子1通过PI3K/Akt信号通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达
背景:采用生长因子等生物学方法修复退变椎间盘是目前椎间盘退变治疗的研究热点,胰岛素样生长因子1能促进髓核细胞增殖、促进功能性细胞外基质的合成,但其机制仍未阐明.目的:观察胰岛素样生长因子1对髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的促进作用,并探讨其信号转导机制.方法:分离培养人髓核细胞,取第3代细胞给予不同质量浓度的胰岛素样生长因子1(0,20,50,100,200μg/L)进行刺激,采用RT-PCR、Western-blot检测聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达.100μg/L的胰岛素样生长因子1作用于髓核细胞,采用Western-blot检测胰岛素样生长因子1对PI3K/Akt信号通路的激活作用,并通过LY294002的应用检测PI3K/Akt通路的抑制对聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的影响.结果与结论:①随胰岛素样生长因子1质量浓度增高,聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达水平逐渐升高,该作用呈剂量依赖性.胰岛素样生长因子1(100μg/L)能显著促进p-PI3K和p-Akt的表达(P<0.01),而LY294002能抑制胰岛素样生长因子1的促进作用(P<0.01);②胰岛素样生长因子1(100μg/L)能促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达(P<0.01),而LY294002能抑制胰岛素样生长因子1对聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的促进作用(P<0.01);③因此认为胰岛素样生长因子1可通过PI3K/Akt通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达.
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针刀治疗膝骨关节炎的实验研究
目的：通过观察针刀干预对膝骨关节炎(KOA)兔行为学、髌韧带(PT)力学特性及膝关节软骨白介素4(IL-4)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)表达的影响,探讨针刀“调筋治骨”法治疗KOA 的作用机制。方法将40只新西兰兔随机分为空白组、模型组、针刀组和电针组,每组10只。模型组、针刀组和电针组采用改良后Videman伸直位固定法建立兔KOA模型。针刀组和电针组造模后分别给予针刀、电针治疗。造模后及治疗后采用改良Lequesne MG的膝关节级别评估法对各组进行行为学评价。治疗后取材,应用Bose Electro Force 3300疲劳试验机对PT进行拉伸、应力松弛和蠕变力学测试,应用ELISA方法检查软骨细胞IL-4表达,应用Real-time PCR法检测MMP-3、Aggrecan mRNA表达水平。结果造模后,模型组Lequesne MG评分与空白组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)；针刀组、电针组Lequesne MG评分与模型组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。针刀组和电针组治疗后Lequesne MG评分与模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01, P＜0.05)；针刀组治疗后Lequesne MG评分与电针组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。模型组PT大应力、大位移、弹性模量及应力松弛率、蠕变率与空白组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05)。针刀组治疗后PT大应力、大位移、弹性模量及应力松弛率、蠕变率与模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05)；电针组治疗后弹性模量与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。模型组造模后IL-4含量、Aggrecan mRNA表达均显著下降,MMP-3 mRNA表达显著上升,与空白组比较差异均有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05)；针刀组及电针组治疗后IL-4含量较模型组明显升高(P＜0.01, P＜0.05),两组Aggrecan mRNA表达均有上升趋势, MMP-3 mRNA表达均有下降趋势,针刀组在调整Aggrecan、MMP-3 mRNA表达方面优于电针组,但与模型组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论针刀治疗KOA的作用机制可能是通过改善韧带力学特性,调整关节内应力环境,通过IL-4力学信号通路,调整Aggrecan、MMP-3 mRNA表达,阻抑软骨退变,从而起到“调筋治骨”的治疗作用。
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正常与退变髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的对比研究
目的 正常髓核细胞(nNPCs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)有诱导分化作用,而退变髓核细胞(dNPCs)对MSCs的诱导作用是否存在差异尚未阐明,文中对比nNPCs与dNPCs对MSCs向髓核细胞分化诱导作用的差异.方法 细胞株/退变患者来源的人NPCs与细胞株来源人MSCs行体外三维共培养,分为5组:nNPCs对照组、dNPCs对照组、MSCs对照组、nNPCs-MSCs组(nNPCs诱导的MSCs)、dNPCs-MSCs组(dNPCs诱导的MSCs),共培养7 d后,行RT-PCR及Western blot检测各组细胞聚集蛋白聚糖(ACAN)、II型胶原(COL-2)、SOX-9、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3的表达水平.结果 RT-PCR结果显示,与nNPCs对照组相比:dNPCs对照组ACAN、COL-2、SOX-9的表达较低(P<0.05),MMP-1、MMP-3的表达相对较高(P<0.01);nNPCs-MSCs组ACAN的表达相对较低(P<0.05);dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达相对较低(P<0.05).与dNPCs对照组相比:nNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达相对较高(P<0.05),MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01);dNPCs-MSCs组MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01).与MSCs对照组相比:nNPCs-MSCs组及dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达均相对较高(P<0.01).与nNPCs-MSCs组相比:dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达相对较低(P<0.05).Western blot结果显示:与nNPCs对照组相比:dNPCs对照组ACAN、COL-2、SOX-9的表达较低(P<0.05),而MMP-1、MMP-3的表达较高(P<0.05);nNPCs-MSCs组MMP-1、MMP-3的表达相对较低(P<0.01);dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9、MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.05).与dNPCs对照组相比:nNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达较高(P<0.05),MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01);dNPCs-MSCs组MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01).与MSCs对照组相比:nNPCs-MSCs组及dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达均相对较高(P<0.01).与nNPCs-MSCs组相比:dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达均相对较低(P<0.05).结论 nNPCs及dNPCs均能诱导MSCs向髓核样细胞分化,与nNPCs共培养后,MSCs的ACAN、COL-2、SOX-9的表达水平与nNPCs相当,优于同样培养条件下dNPCs对MSCs的诱导.
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聚集蛋白聚糖酶-1在退变椎间盘中的表达及意义
[目的]探讨聚集蛋白聚糖酶-1(aggrecannase-1,Agase-1)在退变椎间盘组织中的表达、规律及其意义.[方法]实验组为手术切除的腰椎间盘突出患者的退变椎间盘组织,分为纤维环破裂组和未破裂组;对照组为取自腰椎骨折患者的正常腰椎间盘组织.应用HE染色检测各组椎间盘组织的病理形态学变化,RT-PCR检测Agase-1mRNA的表达;Western印迹法检测蛋白多糖(aggrecan)的含量.[结果]Agase-1mRNA在实验组中表达均明显高于对照组,纤维环破裂组明显高于纤维环未破裂组(P＜0.01),Aggrecan在实验组中的含量低于对照组,纤维环破裂组中Aggrecan明显低于纤维环未破裂组(P＜0.01),HE染色显示髓核细胞数量随着椎间盘退变程度的增加显著减少,纤维环破裂组髓核组织中有血管生成,伴有炎细胞浸润.[结论] Agase-1可能参与了人类椎间盘组织的退变过程,且在突出的椎间盘组织中有增高趋势.
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腺病毒载体搭载的TIMP-3基因对兔椎间盘基质的调节作用
[目的]考察腺病毒载体搭载的重组人组织金属蛋白酶抑制因子-3基因(RAdTIMP-3)转染兔椎间盘后对椎间盘内主要基质成分质量的影响,并探讨其用于椎间盘退变治疗的可行性.[方法]扩增Lac-Z基因标记的RAdTIMP-3和重组腺病毒载体RAd66,并进行纯化、鉴定及滴度测定.将30只日本大白兔随机分入5组,分别向L4、5、L5、6椎间盘内注射生理盐水(第1组)、1.0×1010OPU/mlRAd66(第2组)以及1.0×1010OPU/mlRAdTIMP-3(第3、4、5组)各25 μl.各组分别于注射后2、2、1、2、4周收集标本,X-gal染色检测转染效率,RT-PCR检测TIMP-3及聚集蛋白聚糖核心蛋白的表达,TIMP-3及H型胶原免疫组化染色、藏红O-快绿染色及Tunel染色考察转染对椎间盘基质的调控作用.[结果](1)RAdTIMP-3经扩增和纯化后浓度可达1.9×10TM OPU/ml.(2)RT-PCR显示,3、4、5组TIMP-3基因表达均较1、2组明显增加,3、4、5组核心蛋白基因表达较1、2组略有增强.(3)Tunel染色显示各组凋亡细胞比例无明显差异.(4)第5组藏红O-快绿染色及II型胶原免疫组化染色染色强度均好于1、2组.[结论]RAdTIMP-3能够广泛而安全地在兔椎间盘内表达,并改善椎间盘基质成分的质和量,具备用于椎间盘退变治疗的潜力.
关键词： 组织金属蛋白酶抑制因子-3 椎间盘 聚集蛋白聚糖 Ⅱ型胶原 -
不同浓度TGF-β1对人髓核细胞外基质成分基因表达的调控作用比较
目的 研究在体外培养条件下,不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)对人髓核细胞聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达的调控作用.方法 以传2代人髓核细胞为研究对象,分别以0.1 μg/L、1.0 μg/L、10μg/L、100 μg/L四种浓度的TGF-β1为培养液,设不含生长因子培养液为对照组,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9 mRNA表达情况.结果 0.1 μg/L TGF-β1组与对照组相比,无显著性差异.1 μg/L、10 μg/L和100 μg/L TGF-β1组在促进Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9基因表达方面作用显著,差异均具统计学意义.其中,10μg/L组促进细胞mRNA表达作用明显.结论 TGF-β1能够促进髓核细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9基因的表达,提示TGF-β1有可能在椎间盘退行性疾患的预防和治疗中发挥重要作用.
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流体剪切力对体外培养人关节软骨细胞代谢的影响
目的 检测体外培养人关节软骨细胞在间断剪切力作用下细胞增殖、Ⅱ型胶原mRNA表达和聚集蛋白聚糖mRNA表达的变化,观察流体剪切力对人关节软骨细胞代谢的影响.方法 将传代的第2代软骨细胞分为载荷组和对照组,载荷组按40 r/min每天置于摇床上处理2 h,每天2次;对照组置于培养箱中静止培养.通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学法检测软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Ⅱ型胶原mRNA表达和聚集蛋白聚糖mRNA表达.结果 MTT法测得载荷组吸光度值为0.58±0.05,对照组为0.42±0.06,载荷组吸光度值高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅱ型胶原免疫组织化学检测所得平均吸光度(A)值为:对照组0.184 60±0.036 32,载荷组0.306 10±0.053 00,载荷组Ⅱ型胶原平均吸光度高于控制组,差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR法检测结果 显示对照组和载荷组Ⅱ型胶原mRNA吸光度比值分别为0.080±0.006和0.150±0.005,聚集蛋白聚糖mRNA吸光度比值分别为0.100±0.004和0.230±0.004,载荷组均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 一定强度流体剪切力能够促进人关节软骨细胞的增殖及代谢,使其合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖增多.
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地塞米松对兔髓核细胞增殖及聚集蛋白聚糖表达的影响
目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为两组,实验组给于1～10000 nmol/L地塞米松进行培养,对照组不给于地塞米松,分别培养不同的时间段.采用噻唑蓝(MTT)比色法检测地塞米松对兔髓核细胞增殖的影响;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内Aggrecan mRNA表达的影响.结果 MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,佳作用浓度为100nmol/L,佳作用时间为48 h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Aggrecan表达明显较对照组高,是对照组的2.04倍(0.92/0.45),差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Aggrecan表达增高.
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微小RNA-410对人髓核细胞增殖及分泌表达的影响
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-410对人髓核细胞增殖及分泌表达的影响.方法 实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测人髓核细胞转染miR-410 mimics后miR-410表达水平;转染后细胞培养12、24、48、72 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖;双荧光素酶报告基因检测miR-410与低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的靶标关系;Western blot检测聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白α1链(Col2A1)和HIF-1α的表达水平.结果 与scramble组比较,转染miR-410 mimics后miR-410的表达显著增加(0.85±0.12比2.74±0.34,P=0.015).CCK-8结果显示与scramble组比较,转染miR-410 mimics后细胞存活率逐渐增加,并存在时间依赖性,72 h时显著(1.15 ±0.12比0.62±0.05,P=0.003);miR-410过表达使Aggrecan和Col2A1蛋白表达量显著上升(0.96±0.08比3.23 ±0.29,P=0.003;0.96 ±0.06比2.45 ±0.18,P=0.000).双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-410与HIF-1α存在直接的靶标关系(0.32 ±0.15,P=0.000);miR-410过表达抑制HIF-1α蛋白表达水平(0.53 ±0.04,P=0.007).结论 miR-410过表达促进人髓核细胞增殖并增加Aggrecan和Col2A1表达,其机制可能与靶向抑制HIF-1 α表达有关.
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淫羊藿苷联合地塞米松对人髓核细胞增殖及分泌表达的影响
目的：探讨淫羊藿苷（ICA）与地塞米松（Dex）联合作用对人髓核细胞（hNPs）增殖及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、II型胶原蛋白（Col2a）、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶（MMP-13）表达的影响。方法取生长状态良好的hNPs按不同处理因素分为：control组（只含培养基）、ICA组（20μmol/L ICA）、Dex组（0.2μmol/L Dex）、ICA+Dex 组（20μmol/L ICA+0.2μmol/L Dex）、IL-1β组（10 ng/ml IL-1β）、ICA+IL-1β组（20μmol/L ICA+10 ng/ml IL-1β）、Dex+IL-1β组（0.2μmol/L Dex+10 ng/ml IL-1β）、ICA+Dex+IL-1β组（20μmol/L ICA+0.2μmol/L Dex+10 ng/ml IL-1β），各组作用48 h；CCK-8法检测细胞的增殖；Western blot、RT- PCR以及ELISA检测Aggrecan、Col2a、IL-6、IL-8和MMP-13表达。结果 CCK-8结果显示：与control组比较，低浓度的ICA（≤20μmol/L）和Dex（≤0.2μmol/L）单独作用均提高hNPs存活率但差异无统计学意义（>0.05）。然而，10μmol/L ICA和0.2μmol/L Dex联合用药对hNPs的存活率大于单独用药（<0.05）；Western blot、RT- PCR以及ELISA结果表明：与单独用药组相比，ICA和Dex联合作用促进Aggrecan、Col2a蛋白和mRNA表达（<0.05）；另外，ICA和Dex联合处理抑制IL-1β诱导的hNPs炎症介质IL-6、IL-8的分泌表达（<0.05），同时降低MMP-13蛋白、mRNA水平（<0.05）。结论 ICA与Dex联合作用对促进 hNPs增殖、Aggrecan和 Col2a表达有效果；同时抑制 IL-1β诱导的 hNPs炎症介质 IL-6、IL-8和MMP-13的表达，为椎间盘退行性病变的药物治疗提供理论依据。
