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一起甲型副伤寒沙门菌污染水源所致腹泻暴发疫情的病原学调查
目的 对一起腹泻暴发疫情进行病原学调查,以便明确病因、进行有效的预防控制.方法 采用荧光PCR快速检测、常规病原学分离培养、噬菌体裂解试验、ATB微生物自动鉴定系统等方法对疑似患者、环境水源水和饮用水采样,进行病原学的检测和鉴定.结果 经荧光PCR检测与病原分离培养鉴定,来自患者粪便、血液、水源水和饮用水共12份疑似标本中,10份为甲型副伤寒沙门菌阳性,检出率为83.33%,其中4份来自粪便标本,4份来自血,1份来自水源水,1份来自饮用水.10株不同来源甲型副伤寒沙门菌的血清学分型、生化反应、药物敏感性、噬菌体裂解试验均相同.结论 这是一起由甲型副伤寒沙门菌水源污染所致的腹泻暴发疫情.该菌的检出为本地区腹泻病原谱增加了一种新的病原菌.
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高通量荧光PCR组合方法鉴定16种金黄色葡萄球菌肠毒素的方法建立及评估
目的 建立一种高效、特异的荧光探针熔解曲线方法,用于鉴定16种金黄色葡萄球菌肠毒素.方法 根据金黄色葡萄球菌肠毒素SEA ～ SEQ特异基因序列设计不同杂交连接探针,建立金黄色葡萄球菌肠毒素检测体系,评估其低检出限、特异度、可重复性等指标.与普通PCR方法比较,采用荧光探针熔解曲线方法对本实验室的158株食物中毒金黄色葡萄球菌进行检测,评估新方法的灵敏度和特异度.结果 荧光探针熔解曲线方法低检出限为0.80 ～ 2.15 ng/μl,特异度为100.0％,无交叉荧光信号产生,变异系数＜1％.与普通PCR方法比较,新方法的灵敏度为95.4％,特异度为100.0％,Kappa值为0.88.结论 荧光探针熔解曲线技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法可覆盖金黄色葡萄球菌16种肠毒素,具有快速、准确、特异性高的特点.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素 荧光PCR 荧光探针熔解曲线方法 -
贵阳市纯羊源性食品真实性鉴定调查
本文主要对2017年贵阳市售的纯羊源性食品进行真实性鉴定调查,及时发现羊源性食品的安全隐患,并为市场监管提供参考.方法:由本单位专业抽样人员进行随机抽样,其中包装产品、散装产品、特色产品各10批次,按照SN/T 2051-2008对样品进行检测.结果:包装产品和特色产品未检出非羊源性成分、散装产品有4批次检出非羊源性成分.结论:贵阳市内在售的羊源性食品部分批次存在携带非羊源性成分的情况,市场监督和管理部门应引起重视并加强对相关生产企业或销售摊贩的监督和管理.
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贵阳市纯牛源性食品真实性鉴定调查
对2017年贵阳市在售的纯牛源性食品进行真实性的鉴定调查,是为了及时发现牛源性食品的安全隐患,并为市场监督和管理部门提供参考.方法:由本单位专业抽样人员进行随机抽样,包装产品30批次、散装产品30批次、特色产品10批次,按照SB/T 10923-2012、SN/T 3730.7-2013、SN/T 4397-2015对样品进行检测.结果:包装产品、散装产品中分别有2批次、5批次检出非牛源性成分,特色产品中未检出有非标签明示的指定牛种源性成分的批次.结论:贵阳市内在售的纯牛源性食品部分批次存在携带非牛源性成分的情况,市场监督和管理部门应引起重视并加强对相关生产企业或销售摊贩的监督和管理.
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基于扩增后分析的单管双重荧光PCR方法的建立
目的 建立单通道双重荧光PCR方法检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒,为探索超多重荧光PCR方法奠定基础.方法 根据TOCE原理,首先在寨卡病毒的TaqMan探针荧光PCR技术基础上,设计两条含有不同标签序列的杂交探针,通过寨卡病毒毒株选择合适的标签序列,再根据合适的标签序列设计合成两条理论上解链温度不同的检测探针,同样用寨卡病毒毒株评估两条检测探针;接着按相同原则设计合成基孔肯雅病毒的杂交探针和检测探针,进行单管内单通道双重荧光PCR试验.结果 标签序列的选择结果表明,只有当标签序列的解链温度低于荧光PCR的退火延伸温度时,阳性样本才能获得相应的扩增曲线;根据合适的标签序列设计合成的两条理论上解链温度不同的检测探针,实际检测时可以在同一检测通道中通过融解曲线分析准确区分.单管双重荧光PCR可准确检测出基孔肯雅病毒、寨卡病毒的毒株和阳性样本.结论 建立了一种针对基孔肯雅病毒和寨卡病毒的单通道双重荧光PCR检测方法,为后续多种虫媒病毒超多重荧光PCR检测方法的开发提供借鉴.
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2014和2016年登革病毒检测能力验证结果分析
目的 通过开展登革病毒检测能力验证,不断提高实验室登革病毒的检测水平.方法 登革病毒1-4型毒株经严格灭活,经过特异性、敏感性、均匀性、稳定性测试,随机组合成每组5份样品发放.参加能力验证的实验室自行决定采用的核酸提取方法和检测方法,对样品进行定性或/和分型检测.对登革病毒检测结果进行分析.结果 2014和2016年,全国共有126家实验室参加登革病毒检测能力验证,初测满意率为98.4％,2家实验室的结果判定为"定性检测不满意",占全部参加实验室的1.6％,补测后满意率为100.0％.结论 我国大部分实验室具备较好的登革病毒实时荧光定量PCR检测能力和质量控制及管理水平,可以很好地为有关部门提供技术支持.
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石家庄市市售婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的监测及溶血素基因的分析
目的 了解目前市售婴幼儿配方奶粉、谷基辅助食品样品中蜡样芽胞杆菌的污染及其毒素基因的携带情况.方法 采集石家庄市23个区县市售婴幼儿配方粉、谷基辅助食品共399份,依照国家标准GB/T 4789.14-2003《食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》和《食源性致病菌监测工作手册》进行蜡样芽胞杆菌检测并计数,应用荧光PCR方法检测蜡样分离株的溶血素基因和非溶血素基因.结果 399份样品中蜡样芽胞杆菌检出85份,其中婴幼儿配方奶粉检出36份,检出率22.8％ (36/158);谷基辅助食品检出49份,检出率20.3％(49/241).85份阳性样品中有48份呈溶血素基因阳性,检出率56.5％,非溶血素基因均为阴性.结论 婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的污染较严重,存在潜在的食品风险.分析结果可为婴幼儿食品卫生学检验标准及监督管理等方面提供参考.
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标本溶血对荧光PCR检测HBV-DNA的影响
溶血是血细胞的一些组分释放进入血清或血浆,导致实验样品出现特有的红色增加,这是临床诊断分析中误差的常见原因之一[1],对生化分析和酶促反应的影响是显而已见的,为探讨不同程度溶血标本对荧光PCR检测HBV-DNA结果的影响,分别用已知HBV-DNA阴性和已知浓度的HBV-DNA阳性的血标本,人为造成不同程度的溶血,用荧光PCR的方法测定其结果,观察溶血对其结果的影响.溶血可造成HBV-DNA阳性的标本结果偏高,HBV-DNA阴性的标本影响不大.现报告如下.
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荧光PCR技术在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用
目的：评价实时荧光PCR技术开展作为快速检测从业人员体检肠道致病菌(伤寒、痢疾)检测工作方法的适用性，以替代落后的细菌培养法检测手段的可行性é方法对一定时间从业人员体检的肛拭子，同时用PCR筛查法和传统培养法进行志贺菌和沙门菌对比检测，充分比较两者的检出率、灵敏度、特异性、工作效率、人力成本和耗材成本é结果 PCR筛查法阳性检出率1.6‰；传统培养法阳性检出率0.76‰；PCR筛查法的灵敏度和特异性分别为100%和99.97%，具有操作安全简便、结果客观性强、方法便于规范统一、质量控制措施可操作性强等特点é结论 PCR筛查法检测技术对健康体检人员的肠道致病菌进行快速筛查可以使检验的时间得以缩短，而且特异度强、灵敏度高，兼具时效性与客观性é更适合基层实验室规范统一地开展健康带菌检测工作é
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荧光PCR技术在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用
目的：将实时荧光PCR技术应用于食品及公共场所从业人员肛拭标本的沙门菌与志贺菌检测，对国家卫生标准WS/T454-2014《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案进行实验认证，评价这一新技术开展作为快速检测从业人员体检肠道致病菌（伤寒、痢疾）检测工作方法的适用性，以替代落后的细菌培养法检测手段的可行性。方法对一定时间从业人员体检的肛拭子，同时用PCR筛查法和传统培养法进行志贺菌和沙门菌对比检测，充分比较两者的检出率、灵敏度、特异性、工作效率、人力成本和耗材成本。结果 PCR筛查法阳性检出率1.6‰；传统培养法阳性检出率0.76‰；PCR筛查法的灵敏度和特异性分别为100%和99.97%，具有操作安全简便、结果客观性强、方法便于规范统一、质量控制措施可操作性强等特点。结论 PCR筛查法检测技术对健康体检人员的肠道致病菌进行快速筛查可以使检验的时间得以缩短，而且特异度强、灵敏度高，兼具时效性与客观性，进而防止发生食物中毒及肠道传染病传播。更适合基层实验室规范统一地开展健康带菌检测工作。
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用多重荧光PCR技术鉴别牛肉中掺入的猪马鸭成分的研究
目的 为了敏感、高效地检测掺入牛肉中的低价肉品成分,本研究在常规荧光PCR检测一种掺假成分的基础上,建立了可以同时检测猪和马,马和鸭,鸭和猪的两重荧光PCR检测体系及可以同时检测牛、猪和马,牛、马和鸭,牛、鸭和猪的三重荧光PCR检测体系.方法 配制掺入猪、马、鸭源性成分的模拟牛肉掺假样本,掺假比例分别为15.00％和20.00％,筛选特异性强、敏感度高的猪、马、牛、鸭物种特异性基因,优化反应体系,建立多重荧光PCR扩增体系.结果 研究结果表明,对于单个成分掺假比例分别为5.00％和10.00％的掺假样本,采用两重荧光PCR检测体系可以使各成分100％准确检出.而采用三重荧光PCR检测体系,即使单个成分的掺假比例低至5.00％,所有掺假样本中的各种掺假组分都被准确检出.结论 本研究建立的多重荧光PCR检测体系,可以敏感、特异、准确的检出牛肉制品中掺入的猪、马、鸭成分.
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1567例性传播疾病患者单纯疱疹病毒Ⅱ型病毒感染的临床分析
目的 观察性传播疾病(STD)中单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)临床感染情况.方法 对1 567例患有STD的患者进行泌尿生殖道分泌物HSV-ⅡDNA检测.结果 1 567例STD患者中HSV-ⅡDNA阳性为398例占25.40%,其中男性阳性率26.60%(216/812),女性阳性率24.11%(182/755).泌尿生殖道有明显溃疡的427例中HSV-ⅡDNA阳性320例阳性率74.94%,1 140例无溃疡中HSV-ⅡDNA阳性78例,阳性率6.84%.结论 在STD感染患者中HSV-Ⅱ感染较为常见.泌尿生殖道无溃疡的STD患者中仍存在HSV-Ⅱ病毒的感染.荧光PCR技术检测HSV-Ⅱ感染有较好的临床应用价值,值得临床推广.
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非O1/非O139群霍乱弧菌感染病例分离株分子流行病学分析
目的分析安徽省马鞍山市连续2个月内监测到的6例具有霍乱疑似症状、感染非O1/非O139群霍乱弧菌的病例,判断疫情的聚集性.方法 对病例分离株进行生化和血清型别鉴定以及溶血试验,药敏试验检测抗生素耐药谱,应用荧光PCR和常规PCR进行霍乱弧菌特异基因、毒力及其相关基因的检测,包括ompW、ctx 、tcpA、toxR、hlyA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析其分子型别.结果 生化鉴定和血清学试验鉴别腹泻病例6株菌株为非O1/非O139霍乱弧菌,均产生β溶血；14种药物中有12种属于全部敏感；荧光PCR检测霍乱弧菌特异性基因ompW均为阳性,ctx、tcpA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX基因均为阴性,toxR 、hlyA基因有5株菌扩增阳性,1株菌(1001434446)为阴性；PFGE显示6株菌带型均不相同,但有2株非常相似,分离株与霍乱弧菌产毒株相似性很低.结论 6例感染非产毒的非O1/非O139群霍乱弧菌病例发病虽相对集中,但属于散发病例,在局部地区频繁出现,提示其公共卫生意义不可忽视.
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糖肝康对TAA所致慢性肝损伤模型大鼠肝脏Fas基因表达的影响
目的:探讨糖肝康对糖尿病慢性肝损伤模型大鼠肝脏组织中Fas基因表达的影响.方法:用STZ和TAA建立糖尿病慢性肝损伤大鼠模型,分为正常组、模型组、护肝宁组和糖肝康小、中、大剂量组.模型组、正常组予0.9％氯化钠溶液10mL/kg灌胃;护肝宁组予0.04g/mL护肝宁悬浊液10mL/kg灌胃;糖肝康小、中、大剂量组分别予浓度1、2、4g/mL糖肝康10mL/kg灌胃.12周后,用荧光PCR测肝脏中Fas基因的表达.结果:与正常组比,模型组Fas的表达明显升高(P＜0.01);与模型组比,护肝宁组和糖肝康小、中、大剂量组Fas的表达均明显减少(P＜0.01,P＜0.05);糖肝康大剂量组与护肝宁组比,差异显著(P＜0.05).结论:慢性肝损伤的发生发展可能与Fas基因的异常表达相关,糖肝康可通过抑制Fas基因表达水平,起到对肝脏的保护作用.
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STD门诊患者沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌与人乳头瘤病毒感染情况分析
目的 了解本地区STD门诊患者沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、淋球菌(NG)与人乳头瘤病毒(HPV)感染情况,从而指导临床诊断与用药.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)结合Taqman技术,对采集自来院就诊STD门诊患者的女性宫颈口分泌物、男性尿道口分泌物及相关尿液标本中的特异性DNA核酸片段进行荧光PCR检测.结果 CT、UU、NG、HPV四种病原体总感染率分别为7.49％、42.92％、3.11％和3.06％,除HPV外其它三种病原菌感染率存在性别差异;其中以UU感染率居首位,女性明显高于男性;二重感染率为5.76％,三重感染率为0.83％,未见四重感染,其中以CT和UU二重感染常见;不同年龄段感染情况显示,以40岁以下年龄段感染率高.结论 将HPV纳入泌尿生殖感染检测很重要;通过本研究也发现,无论单一病原体感染还是混合感染,除HPV外均存在明显的性别分布差异,而且两种感染的性别分布相一致;40岁以下年龄段为主要传染源和高危人群,应作为性传播疾病防治工作的重点;双重感染和三重感染较常见,应引起高度重视;目前未发现四重感染.
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生殖支原体TaqMan荧光PCR检测方法的建立
目的 建立一种快速、灵敏、特异的生殖支原体TaqMan荧光PCR检测方法. 方法 选取生殖支原体mg219基因保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan探针,建立并优化荧光PCR检测方法.对优化后的方法进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的生殖支原体常规PCR方法进行比较. 结果 建立的荧光PCR方法对生殖支原体的检测限约为10 copies,高于常规PCR的102 copies,并缩短检测时间100 min.用该方法扩增20种病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100％. 结论 建立的荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地检测生殖支原体,有望用于临床标本检测.
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2006～2010年湖北省流行性脑脊髓膜炎病原学和血清学监测分析
[目的]分析湖北省2006～2010年流行性脑脊髓膜炎(流脑)病原学和血清学监测结果,掌握湖北省流脑的变迁规律.[方法]对2006～2010年分离的脑膜炎奈瑟菌(Nm)菌株进行生化鉴定、血清学分型和药物敏感性检测,并采用多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分子分型；对所有的脑脊液和血液标本进行Nm种属特异性荧光PCR检测；对健康人群血清,运用血清杀菌试验(SBA)进行C群杀菌力抗体水平测定.[结果]2007年湖北省Nm以B群为主,2008～2010年以来C群为优势菌群；对青霉素等6种抗生素均敏感,但对环丙沙星、米诺环素、萘啶酸、复方新诺明4种抗生素出现多重耐药；分子分型结果显示,湖北省B群Nm菌株具有高度的遗传多样性,未发现明显优势的克隆群,C群优势病原株为ST-4821型.RT PCR检测(988份脑脊液)确诊29例流脑病例,其中C群22例,A群2例、B群5例.C群杀菌力总保护率(抗体滴度≥1∶8)为38.10％.[结论]湖北省流脑菌株发生了从B群散发到C群流行的变迁,人群对C群Nm的免疫力不足.
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弹回引物鉴定军团菌属与嗜肺军团菌
目的：设计一种弹回引物荧光PCR方法鉴定军团菌属和嗜肺军团菌。方法通过分析军团菌16S rRNA基因序列，采用生物信息学方法设计引物，优化实验条件，对方法的特异性、灵敏度进行评估，并对186株环境军团菌分离株与15份环境水样进行鉴定。结果经弹回引物检测，军团菌属菌株在85℃～86℃处有扩增子熔解峰，嗜肺军团菌在71℃处有探针结合区熔解峰，非军团菌未检测到熔解峰。弹回引物对标准菌株DNA与模拟水样灵敏度分别为1 ng／μl与（1×103～1×104）／ml。弹回引物对环境分离株验证实验中，成功鉴定了186株军团菌和44株嗜肺军团菌；对15份环境水样直接检测，检出12份军团菌属阳性水样与4份嗜肺军团菌阳性水样。结论弹回引物荧光PCR方法可用于军团菌属和嗜肺军团菌的鉴定，具有较高的特异性与灵敏度。
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生物制品中猪细环病毒污染检测方法的建立和初步应用
目的：建立生物制品中猪细环病毒（ Torque teno sus virus，TTSuV）污染的检测方法，并进行方法学分析及初步的应用。方法针对TTSuV保守序列设计引物和探针，建立荧光PCR方法，对方法的特异性、线性、精密度、低检测限等参数进行验证，并对试验样本对检测的干扰性进行分析。利用该方法对猪全血样品、生产用细胞及轮状病毒疫苗样品进行检测，通过建立TTSuV分型检测的PCR方法对阳性样品进行分型。结果荧光PCR法的特异性较好，与不同种属的细小病毒、猴SV40病毒及猪圆环病毒无明显的交叉反应，TTSuV1和TTSuV2荧光PCR分别在109～103拷贝／μl和109～102拷贝／μl范围内线性较好，R2值达到0．993以上，TTSuV1和TTSuV2的低检测限分别为1×103拷贝／μl和1×102拷贝／μl，试验内和试验间的Ct的精密度CV值均小于7％，试验内病毒拷贝数的CV值小于25％，试验间CV值小于45％。细胞样品成分对病毒检测无明显的干扰性。对20份猪全血样品进行检测，8份为阳性，其中1份为TTSuV1阳性，4份为TTSuV2阳性，3份为TTSuV1／2混合感染。 TTSuV1和TTSuV2型与标准株序列同源性分别为98％～99％和98％。对细胞样品和轮状病毒疫苗进行检测，结果均为阴性。结论成功建立了TTSuV荧光PCR检测法，能够用于生物制品TTSuV污染的检测，进一步提高了生物制品的安全性。
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核酸测序法与荧光PCR法测定HBV基因分型比对试验分析
目的 对核酸测序方法和荧光PCR法用于乙型肝炎病毒(HBV)分型检测的灵敏度、特异度和分型准确性进行比对分析.方法 核酸测序方法作为金标准与荧光PCR法检测结果进行分析,计算乙型肝炎病毒(HBV)分型检测的灵敏度、特异度和分型准确性.结果 200例样本中,金标准检测结果阳性78例;在这78例中,荧光PCR法检测结果阳性78例,荧光PCR法用于乙型肝炎病毒(HBV)检测的灵敏度为100.00%;金标准检测结果阴性122例,荧光PCR法检测结果阴性121例,荧光PCR法用于乙型肝炎病毒(HBV)检测的特异度为99.18%.荧光PCR法用于乙型肝炎病毒(HBV)分型检测的分型准确性为100%.荧光PCR法和金标准方法的分型检测结果,无统计学差异.结论 荧光PCR法具有高灵敏度、高特异度、防污染能力强、自动化程度高、速度快等优点,适合用于传染病监测和临床使用的乙型肝炎病毒(HBV)的分型快速检测.
