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大肠杆菌O157:H7的致病基因与致病因子
本文介绍了与肠出血性大肠埃希菌O157:H7致病性有关的主要致病基因及其相应的致病因子,如使宿主粘膜细胞产生损伤的eae基因与intimin、由特异性噬菌体上slt基因编码的SLTs、O157:H7特异性质粒上溶血素基因编码的溶血素(hly)等.
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055副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展
副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌,可引起急性胃肠炎和原发性败血症.副溶血性弧菌能够产生3类溶血素,包括不耐热溶血素(TLH)、耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH).TLH、TDH和TRH分别由tlh、tdh和trh基因编码.副溶血性弧菌溶血素基因的检测通常采用PCR和核酸杂交,复合PCR和实时荧光定量PCR是未来检测技术应用的趋势.
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石家庄市市售婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的监测及溶血素基因的分析
目的 了解目前市售婴幼儿配方奶粉、谷基辅助食品样品中蜡样芽胞杆菌的污染及其毒素基因的携带情况.方法 采集石家庄市23个区县市售婴幼儿配方粉、谷基辅助食品共399份,依照国家标准GB/T 4789.14-2003《食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》和《食源性致病菌监测工作手册》进行蜡样芽胞杆菌检测并计数,应用荧光PCR方法检测蜡样分离株的溶血素基因和非溶血素基因.结果 399份样品中蜡样芽胞杆菌检出85份,其中婴幼儿配方奶粉检出36份,检出率22.8％ (36/158);谷基辅助食品检出49份,检出率20.3％(49/241).85份阳性样品中有48份呈溶血素基因阳性,检出率56.5％,非溶血素基因均为阴性.结论 婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的污染较严重,存在潜在的食品风险.分析结果可为婴幼儿食品卫生学检验标准及监督管理等方面提供参考.
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肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法
我们曾和美国马利兰大学发展了鉴定肠出血性大肠埃希杆菌的探针，其特异性和灵敏性极高。经序列分析发现该探针是溶血素基因的部分片段。我们又从溶血表型进一步完善了这一鉴定方法。由于其溶血条件特殊，人们一直认为该菌不溶血。我们将经验总结报告如下。 一、材料和方法 1．菌种来源：肠出血性大肠埃希杆菌882364，1986年江苏省徐州市卫生防疫站分离，经本实验室鉴定，并保存。851006为本实验室筛选到的溶血素基因的天然缺失株（对照菌株）。 2．菌株鉴定：生化鉴定为大肠埃希菌。O157单抗和H7血清为本实验室制备。用O157：H7 PCR诊断试剂盒检测882364、851006的溶血素基因，882364的扩增结果为阳性，851006为阴性。 3. 血平板的制备［1］：脱纤维羊血用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入至终浓度为3%。培养条件：于混合气（8%CO2，40%H2，52%N2）环境中37℃培养16 h，然后置21℃空气中6 h。 4．液体溶血活性检测［2］：(1)标准1%羊红细胞的制备；(2)活化菌体；(3)活性检测。 二、结果血平板检测的结果需对光观察，如发生溶血，可见菌落周围透明溶血环。液体溶血检测的结果如只需定性，则A值大于完全不溶血管即可；如需相对定量，可用溶血单位（HU）表示，一个溶血单位(HU)为裂解50%羊红细胞的检测样品的量。
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快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立
目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法.方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65 ℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定.利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性.用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性.结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增.LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml.LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min.结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法.
关键词： 环介导等温扩增 单核细胞增生李斯特菌 溶血素基因 -
不同来源金黄色葡萄球菌溶血素基因分布研究
目的 了解金黄色葡萄球菌溶血素的携带情况,为金黄色葡萄球菌的防治及溯源提供依据.方法 采用PCR扩增分别检测食品、临床患者和游泳池水等不同样本中hla、hlb、hlg和hld四种溶血素基因的分布情况,电泳检测扩增产物.结果 317株金黄色葡萄球菌中,hla、hlb、hlg、hld四种溶血素基因的检出情况分别为85.5％、76.3％、89.6％、89.0％;在2008-2012年之间,四种溶血素基因的检出率无统计学差异.317株金黄色葡萄球菌中共有11种溶血素基因分布模式,检出率高的模式为hlb/hlg,占71.9％,其次为hla/hld (70.3％),少的是hla/hlb/htg/hld (36.3％),不合溶血素基因的占2.2％.多数模式在3种来源菌株中的分布模式均有所不同.2008-2012年,每年同时检出hla、hlb、hlg、hld的菌株阳性率分别为45.7％、29.4％、32.5％、33.3％和32.1％.结论 不同来源金黄色葡萄球菌中,溶血素基因携带及同时含有两种或者以上的情况普遍存在.
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单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因的原核表达
目的为获得大量的单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lmo)溶血素(Hemolysin,hly)蛋白,以便研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制方面的作用.方法本文应用Primer Premier 5.00设计引物,引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点,以前期合成构建的pMD18-T-hly质粒为模板,通过PCR方法扩增出Lmo 0586株溶血素基因.相应酶切后,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建pGEX-6p-hly重组质粒,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达.带有重组质粒pGEX-6p-hly的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及免疫印记分析.结果 PCR体外扩增hly基因产物大小约为1 624bp,成功构建了重组表达质粒pGEX-6p-hly;SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为72ku,重组蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的20.8%;Western免疫印记表明具有良好的反应原性.结论在国内首次构建重组质粒pGEX-6p-hly,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,同时该蛋白具有特异的抗原反应性,为研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制中的作用奠定了基础.
关键词： 单核细胞增生性李斯特氏菌 溶血素基因 载体pGEX 原核表达 -
鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定
目的对分离自发病欧洲鳗鲡的创伤弧菌疑似菌株进行准确的鉴定.方法首先尝试利用一对16S rRNA基因特异性通用引物PCR扩增一株鳗源创伤弧菌疑似株的基因组DNA,得到一个约500bp的DNA片段, 将该DNA片段亚克隆至pMD18-T载体,鉴定克隆化成功之后,送专业公司进行测序,得到一个502bp 的DNA产物,NCBI上同源性比较表明,该片段与GeneBank上注册的创伤弧菌的16S rDNA序列同源性高(100%),同时排除了哈维氏弧菌的可能.设计一对创伤弧菌溶血素特异性引物,实现了对鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定.结果建立一种简洁的鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定方法.结论国内首次自发病欧鳗分离到创伤弧菌,并给出分子鉴定证据.
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问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定
目的 对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定.方法 以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白.制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定.RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录.结果 在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性.RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录.结论 问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因.
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单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及原核表达载体构建
目的构建单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LMO)溶血素基因重组表达质粒.方法本文采用PCR方法扩增出LMO 0586株溶血素(Hemolysin,hly)基因,将其克隆到pMD18-T中,筛选带有插入片段的阳性质粒.经酶切和PCR鉴定,然后进行测序.继而用SalⅠ和XbaⅠ双酶切阳性质粒,目的片段定向插入pPROEXTMHTa中进行鉴定.结果 hly基因体外扩增产物大小约为1646bp.核苷酸序列鉴定后,其核苷酸序列与国外报道的LMO F6789株、LMO F2365株同源性分别为99.70%和99.39%.推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较,同源性分别为99.82 %和98.90%.重组表达质粒经PCR及酶切鉴定表明为正确重组子.结论在国内首次克隆到LMO hly全基因,并构建出含hly基因的原核表达载体.此项工作为进一步LMO溶血素基因的表达奠定了基础.
关键词： 单核细胞增生性李斯特氏菌 溶血素基因 克隆与测序 表达载体构建 -
迟缓爱德华氏菌溶血相关基因的克隆
目的研究迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda Et.)重要毒力因子的溶血素.方法用鸟枪法将Et-12株的染色体经Sau3A酶切后,连接在质粒pACYC184上. 结果在抗性绵羊红细胞平板上,筛选出7株溶血相关克隆子,其中2株能稳定表达, 并将1株重组质粒经酶切后,发现其酶谱和大小和国外报告的不同.经斑点杂交,证实该溶血相关基因在Et-12染色体上.结论可能克隆到新的Et-12溶血相关基因.
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钩端螺旋体溶血素基因的鉴定
对钩端螺旋体诠释的溶血素基因进行确认和分类.利用生物信息学预测的方法,对钩端螺旋体诠释的溶血素基因进行分类并对其进行克隆和表达,通过体外溶血实验验证其溶血活性.并且,使用TLC和HPLC法检测了预测的鞘磷脂酶类溶血素基因的水解鞘磷脂的性质.所有钩端螺旋体诠释溶血素基因可分为:鞘磷脂酶类和非鞘磷脂类.其中8个证实它们确实具有溶血活性.并且,通过TLC和HPLC法证实了利用生物信息学预测的4个鞘磷脂酶类溶血素确实具有水解鞘磷脂的活性.钩端螺旋体基因组中至少含有9个溶血素基因.
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荧光PCR检测蜡样芽孢杆菌及溶血素基因应用研究
目的 建立实时荧光PCR检测蜡样芽孢杆菌的快速检测方法,为食品中蜡样芽孢杆菌污染的调查及食物中毒的快速准确定量检测提供手段.同时检测34株蜡样芽孢杆菌溶血素基因,了解各种食品中蜡样芽孢杆菌溶血素基因分布情况.方法 将广西各地食品样品蜡样芽孢杆菌分离株经纯化培养,提取DNA,应用荧光PCR进行确认检测,并检测34株疑似蜡样芽孢杆菌溶血素基因及非溶血素基因.结果 除1株荧光PCR检测为阴性外,其余33株均为阳性,符合率为97.1%;11株溶血素基因阳性,检出率为32.4%;非溶血素基因均为阴性.结论 实时荧光定量PCR检测特异性高,检测时间短,可应用于蜡样芽孢杆菌食物中毒的快速准确定量诊断.
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单核细胞增生李斯特菌hlyA基因实时荧光PCR的建立与研究
目的 建立单核细胞增生李斯特菌hlyA基因TaqMan探针实时荧光PCR,用于食品卫生检验的快速筛查.方法 根据单核细胞增生李斯特菌hlyA基因设计特异的引物与TaqMan探针,建立和优化实时荧光PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,并在食品卫生检验中与细菌分离方法同步应用比较.结果 建立了单核细胞增生李斯特菌TaqMan探针实时荧光PCR反应体系,经优化其佳退火/延伸的温度为58℃,25 μL反应体系中上、下游引物和探针佳终浓度配比分别为0.7、0.7、0.4 μmol/L;该实时荧光PCR反应体系可在35 min内完成检测,与沙门菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌等16种非目标菌无交叉反应,对阳性克隆质粒的检测下限可达100拷贝/μL的稀释梯度,对同一核酸浓度样本20次检测的Ct值变异系数为0.46％;在对120份食品安全风险监测标本的快速检测应用中,6份标本单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR扩增阳性,从相应样本中分离出6株单核细胞增生李斯特菌,实时荧光PCR与分离培养方法检测结果相一致.结论 针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因建立的TaqMan探针实时荧光PCR具有快速、特异、灵敏、稳定等优势,可用于食品卫生检验中单核细胞增生李斯特菌的快速、高效筛查.
关键词： 单核细胞增生性李斯特菌 实时荧光PCR 溶血素基因
