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西帕依固龈液对口腔白色念珠菌体外溶血活性研究
目的 探讨白色念珠菌的溶血活性以及西帕依固龈液对白色念珠菌的溶血活性产生的影响.方法 将白色念珠菌接种于3组沙博氏平皿培养基,其中一组加入西帕依固龈液,一组加入氟康唑,另外一组为只加培养基的对照组,检测溶血活性.结果 只加入培养基的对照组和西帕依固龈液组和氟康唑组均产生溶血现象,而西帕依固龈液组和氟康唑组的溶血现象显著减少,西帕依固龈液组和氟康唑组两者之间无显著性差异(P＞0.05).西帕依固龈液组、氟康唑组和加培养基的对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 西帕依固龈液能使白色念珠菌感染的毒性有效降低,可以指导临床上治疗口腔白色念珠菌感染用药.
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热带假丝酵母菌临床分离株毒力表型特征研究
目的 描述临床分离的热带假丝酵母菌培养不同时间的天冬氨酰蛋白酶活性(蛋白酶活性)、磷脂酶活性和溶血活性,并分析不同感染部位分离菌的蛋白酶活性和溶血活性差异.方法 将分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌鉴定后分别接种在牛血清蛋白培养基、卵黄琼脂培养基和羊血琼脂培养基上,培养不同时间(24、48和72 h)后检测蛋白酶活性、磷脂酶活性和溶血活性.结果 热带假丝酵母菌培养24、48和72 h时均具有蛋白酶活性和溶血活性,但未表现出磷脂酶活性;热带假丝酵母菌在48和72 h时的蛋白酶活性高于其在24 h时的活性,在72 h范围内,溶血活性随培养时间延长持续增长;分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌的蛋白酶活性(P=0.368)和溶血活性(P=0.985)差异无统计学意义.结论 我国热带假丝酵母菌临床分离株培养不同时间具有蛋白酶活性和溶血活性,但无磷脂酶活性.
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抗肺炎链球菌溶血素蛋白单克隆抗体的制备及表征
肺炎是导致全球5岁以下儿童发病或死亡的常见疾病［1］。目前市售疫苗均为多糖或多糖结合组分，难以对90多种肺炎链球菌进行广谱的覆盖，且随着疫苗的广泛应用，血清型替代现象也日趋严重［2］。为解决这些问题，以肺炎链球菌蛋白作为疫苗组分的蛋白疫苗被寄予厚望。肺炎链球菌溶血素蛋白（ Ply）在所有肺炎链球菌株中均表达且高度保守，成为广谱肺炎蛋白疫苗的候选组分。前人研究表明，Ply在肺炎链球菌感染模型上，与野生型相比较，Ply的缺失与肺部损伤的降低、细菌菌落数的降低、肺部中性粒细胞的减少及延长生存时间等具有直接关联［3］。天然结构的 Ply （Plywt）溶血活性极强，对细胞毒性很大，无法直接作为免疫原，本实验室制备了Plywt的减毒突变体Plym2。本研究利用Plym2研制了Ply的单克隆抗体，用于建立准确简便的检测Ply的方法。
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问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1～sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1～spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1～sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1～rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1～rSpM.采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1～sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1～rSph4.rSph1～rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1～sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1～sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.
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创伤弧菌溶细胞素vvhA基因在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控
目的 用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,对其溶血活性进行评价.并观察其作用肝癌细胞SMMC7721后,调控肝癌细胞SMMC7721应激因子基因表达情况.方法 构建pET28a(+)-whA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲和层析(6×His Tag)纯化重组创伤弧菌溶细胞素(rVVC),并用溶血试验验证重组蛋白活性.复性重组蛋白作用肝癌细胞SMMC7721后,RT-PCR方法 检验SMMC7721细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、热休克蛋白90(HSP90)基因分泌调节情况.结果 用基因工程的方法 成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)rVVC.兔红细胞溶血试验检测表明,rVVC具有溶血活性,其活性为0.2 μg/HU(溶血单位).RT-PCR结果显示,rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达能力,但具有时间、剂量依赖性.结论 表达、纯化并复性的rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达.提示rVVC在组织细胞损伤过程中发挥了应激作用.
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钩端螺旋体溶血素Sph2表达模式及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡活性
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法 采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段,T-A克隆后测序.构建sph2基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检查重组Sph2(rSph2)的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rSph2.采用绵羊血平板溶血试验及血红蛋白分光光度法测定rSph2的溶血活性.采用流式细胞术检测rSph2诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和肝细胞株IAR20凋亡的活性,实时荧光定量PCR检测赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞前后sph2基因mRNA水平变化.结果 与GenBank中sph2基因比较,所克隆的sph2基因序列相似性为100%.所构建的原核表达系统能高效表达rSph2.rSph2以浓度依赖方式溶解绵羊红细胞.10 μg/ml rSph2可诱导J774A.1和IAR20细胞凋亡,凋亡率峰值分别为23.96%和32.92%.赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞后0.5～2 h内sph2基因mRNA水平显著升高,2 h后mRNA水平迅速下降.结论 钩体sph2基因呈宿主细胞接触式瞬时表达.rSph2有溶解绵羊红细胞及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡的活性,因而Sph2是钩体致病过程中重要的毒力因子.
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两株副溶血弧菌标准株的肠毒性及细胞毒性和溶血活性比较
目的评价两株副溶血弧菌标准株在肠毒性、细胞毒性和溶血活性上的毒力差异。方法通过兔回肠袢实验、Raw264细胞毒性实验和兔红细胞溶血实验比较临床分离株RIMD2210633（ tdh＋、T3SS1＋、T3SS2α＋、T3SS2β-、trh-）和环境分离株S251（tdh-、T3SS1＋、T3SS2α-、T3SS2β-、trh-）的毒力表型差异。结果 S251株产生的肠积液量、对Raw264细胞的细胞毒性均弱于RIMD2210633株[（12.37±1.07） ml vs．（1.50±1.50）ml；（35.69±3.07）％vs．（14.07±0.91）％]，且有统计学差异（P＜0.05），另外S251株对兔红细胞的相对溶血活性明显弱于RIMD2210633株，且具有统计学差异（ P＜0.01），这与基因预测结果相符。结论 S251株的肠毒性、Raw264细胞毒性和溶血活性均弱于RIMD2210633株，该两株菌可作为后续副溶血弧菌致病机制研究的模式菌株。
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消化道肿瘤中穿孔素溶血活性的变化
目前的大量研究已证明,穿孔素(pore-forming protein,PFP,Perforin)是具有杀伤活性的淋巴细胞如NK,LAK,CTL等在杀伤靶细胞过程中的重要细胞因子.体内的免疫监视功能无力,尤其是细胞免疫功能下降,杀伤细胞活性降低是造成肿瘤细胞在体内生长,转移的重要因素.外周血单个核细胞(PBMC)穿孔素活性的检测能从一个方面反映PBMC中具有杀伤功能的NK,CTL等细胞在体外杀伤靶细胞的能力.我们探讨PBMC穿孔素溶血活性的测定以及消化道肿瘤患者PBMC穿孔素溶血活性的变化情况.报告如下.
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金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备
目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）重要的外分泌毒力因子α-溶血素（alpha hemolysin， Hla），检测Hla蛋白对不同种属红细胞的裂解作用；制备其特异性抗体，并检测抗体的中和活性。方法以SAU NCTC-8325菌株基因组为模板，PCR扩增hla基因，构建重组表达载体pET-28a-Hla，转化大肠杆菌BL21（DE3），利用IPTG诱导表达，通过Ni2＋柱亲和纯化获得Hla蛋白；通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性。结果重组Hla蛋白以可溶形式表达，细胞裂解实验表明，纯化的Hla蛋白可以显著裂解兔红细胞，但人红细胞和羊红细胞对Hla杀伤作用不敏感。 ELISA结果表明，获得了效价较高的多克隆抗体。该抗体可以有效抑制Hla对兔红细胞的裂解作用。结论 SAU的Hla蛋白对不同种属红细胞的溶解能力不同，为探讨Hla裂解细胞的机制给予一定的提示；同时所制备的特异性抗体（ anti-Hla）可以抑制Hla的溶血作用，为深入研究Hla的致病机制奠定了基础。
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金黄色葡萄球菌β-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备
目的 利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌外分泌毒素β-溶血素(β-hemolysin , Hlb )及其突变体HlbH-149-N ,检测其生物学活性,并制备其功能性抗体,探讨Hlb蛋白在金葡菌感染中的生物学意义. 方法 以金葡菌NCTC-8325基因组为模板,利用PCR技术扩增目的基因hlb,进一步构建重组表达载体pET28a-hlb,并转至大肠杆菌BL21(DE3),利用点突变技术构建重组表达载体pET28a-hlbH-149-N,经IPTG诱导表达目的蛋白,通过Ni2+柱亲和纯化获得Hlb蛋白及突变体HlbH-149-N蛋白;通过溶血实验检测Hlb及突变体HlbH-149-N蛋白的生物学活性,并制备Hlb特异性抗体,检测抗体的中和活性. 结果 获得了纯度较高的重组Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白,溶血活性实验结果表明,重组Hlb蛋白能够裂解绵羊红细胞,而突变体HlbH-149-N蛋白不能裂解绵羊红细胞;不同物种红细胞对Hlb敏感性不同;制备了抗Hlb蛋白的多克隆抗体(anti-Hlb),ELISA和Western印迹实验结果表明,anti-Hlb能特异结合Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白,同时发现,anti-Hlb可有效抑制Hlb对绵羊红细胞的裂解作用. 结论 获得了具有良好溶血活性的重组Hlb蛋白以及无溶血活性的突变体HlbH-149-N蛋白,并制备了具有中和活性的特异性抗体,为深入研究Hlb在金葡菌致病过程中的作用奠定了基础.
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一种定量测定副溶血弧菌溶血活性的方法
目的 建立定量评价副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)溶血活性的实验方法.方法 以大耳白兔红细胞为靶细胞,野生型VP标准株RIMD2210633(J5421)、opaR敲除株、toxR敲除株的菌体细胞为效应细胞,通过调节感染菌量及孵育时间来优化条件,从而建立溶血活性评价模型.结果 与结论 VP佳溶血活性条件为红细胞终浓度5%条件下,用约3×106 CFU的菌量感染靶细胞,37℃孵育2.5 h.opaR负调控VP的溶血活性,而ToxR正调控VP的溶血活性.本研究成功建立了定量测定VP溶血活性的方法.
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沙蜇毒素的提取及溶血活性分析
目的:血栓形成是引发严重心脑血管疾病的病理基础,溶栓药物可消除血栓并减轻并发症.本研究从生物组织中提取分离的具有溶血活性的物质,有望成为有效的溶栓制剂,为血栓的治疗提供新方法.方法通过海水自溶、离心、低温研磨等方法从沙蜇触手的刺丝囊中提取沙蜇毒素,对沙蜇毒素提取液进行分离纯化,测定了毒素的溶血活性并绘制溶血曲线;深入研究了温度、介质的pH值对其溶血活性的影响.结果研究证实:沙蛰毒素具有很强的溶血活性,且对温度敏感,其活性受pH变化影响很大.粗毒素提取液分离出性能完全不同的2个组分,其中仪第一组分有溶血活性,第二组分未检测到溶血活性.结论研究结果提示沙蛰毒素有望用于改善生物材料的抗血栓性能.
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自制中药含漱液治疗真菌感染疗效观察
目的:研究自制中药含漱液在控制真菌感染患者念珠菌检出率的作用,及对念珠菌分离株毒力的控制.方法:将300例真菌感染患者分为中药组和碳酸氢钠组.用药前和用药后7天分别采用含漱液浓缩培养法,并结合应用芽管试验、厚膜孢子形成试验及温度试验常规培养等方法分离菌株并计数.将分离、纯化的念珠菌株,接种于血琼脂平板上,厌氧培养,检测其溶血活性.结果:治疗前两组菌落数差异无统计学意义(P＞0.05).采用两种不同药物含漱7天后,治疗前后菌落数比较,中药组较碳酸氢钠组差异有显著性意义(P＜0.01);用药前所有念珠菌菌株在接种于血琼脂平板培养48h后均产生了溶血,溶血活性比较无统计学意义(P＞0.05).用药前后溶血活性比较,两组差异有显著性意义(P＜0.01).结论:中药能有效控制真菌感染患者念珠菌检出率,真菌感染患者携带念珠菌株能产生溶血因子,可导致真菌感染患者病情加重或迁延不愈.中药在控制念珠菌毒力方面有显著效果.
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金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性
目的 原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性.方法 采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒pET28a-hlaH35L.将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用.结果 重组表达质粒pET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒pET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符.表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50％,纯化后纯度均在90％以上.Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg; HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用.结论 成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础.
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乙型肝炎和肝硬化患者补体旁路溶血活性的观察
补体参与机体免疫反应,补体测定可有助予了解机体的免疫功能及观察病情.关于补体经典途径溶血活性(CH50)和补体C3、C4测定对肝炎和肝硬化患者的临床意义,国内外已有很多报道,但对补体旁路途径溶血活性(ACH50)的临床研究却甚少.
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发形霞水母触手提取物的蛋白稳定性及其溶血活性
目的：探讨不同环境因素和处理方法对发形霞水母（ Cyanea capillata）触手提取物（ tentacle extract ， TE）蛋白稳定性及其溶血活性的影响。方法结合蛋白浓度测定、溶血活性检测和SDS-PAGE分析等方法研究不同环境因素和处理方法对TE蛋白稳定性及其溶血活性的影响。结果 TE溶血活性呈明显的剂量依赖关系，其半数溶血分数HU50＝226μg／ml；40℃水浴1 h，能去除TE中大量杂蛋白，但仍保持显著溶血活性；TE在4℃放置28 d，其溶血活性保持稳定，25℃下3 d内其溶血活性变化不明显；pH值对TE溶血活性的影响呈钟形曲线，在pH 6．0～11．0之间活性相对稳定，pH 8．0是TE保持溶血活性的优pH条件；不同缓冲液对TE稳定性及其溶血活性影响显著，浓度大于26％的硫酸铵溶液对TE溶血蛋白具有良好的盐析作用。结论40℃水浴1 h预处理可显著减少TE中非活性蛋白组分，并降低样品黏性；4℃和pH 8．0是TE保持蛋白稳定性和溶血活性的适条件；浓度大于26％的硫酸铵盐析有利于溶血蛋白组分富集。
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发形霞水母毒素分离产物溶血活性的比较及其影响因素分析
目的:分离发形霞水母刺丝囊毒素(nematocyst venom,NV)与无刺丝囊触手提取物(tentacle-only extract,TOE),比较二者的溶血活性,分析其影响因素.方法:采用自溶、离心方法分离发形霞水母NV和TOE,比较二者的溶血活性,观察提取物浓度、温度和pH值等因素对二者溶血活性的影响.结果:成功分离到NV与TOE;二者浓度相关溶血活性曲线均呈"S"形,溶血分数50%时所对应的质量浓度(HU50)分别为8μg/ml和67μg/ml,前者溶血活性强度约为后者的8.4倍;温度对二者溶血活性影响较大,大溶血活性都出现在40℃;pH值对二者溶血活性也有影响,在pH 8处二者都具有大的溶血活性,但后者较前者更为敏感.结论:发形霞水母毒素分离产物NV和TOE均具有溶血活性,且前者强于后者;二者溶血活性受浓度、温度和pH值的影响.
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金黄色葡萄球菌与枯草杆菌间的类似CAMP现象
B群链球菌能产生"CAMP因子",可与金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)产生的β溶血素作用而增强其溶血活性,在两种菌垂直划线交界处出现箭头型透明溶血区,是为CAMP试验阳性.链球菌中只有B群CAMP试验阳性,因此可用于B群链球菌的鉴定[1].近,我们在金葡菌与枯草杆菌之间发现了一种类似的CAMP现象.
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沙蜇刺丝囊毒素的分离提取及其溶血活性稳定性研究
目的:研究沙蜇刺丝囊毒素的提取及其溶血活性稳定性的影响因素.方法:通过自溶法制备沙蜇刺丝囊细胞,利用超声波破碎细胞提取毒素,再将毒素置于不同温度、不同pH值及不同浓度的乙二胺四乙酸(EDTA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及二价金属离子溶液中孵育后,加入到人血红细胞溶血反应体系中,测定上述理化因素对沙蜇刺丝囊毒素溶血活性稳定性的影响.结果:成功提取到沙蜇刺丝囊毒素,其半溶血率(HU50)约为26.38 mg/L;毒素的溶血活性受温度影响较大,37℃时溶血活性强;溶血活性在弱酸性条件下较稳定,pH4.8时毒素的溶血活性大;EDTA和GSH对毒素溶血活性具有稳定作用,而二价金属离子Ca2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+和Zn2+能不同程度的抑制其活性.结论:沙蜇刺丝囊毒素具有溶血活性,其活性的稳定性受温度、pH值、EDTA、GSH及二价金属离子影响.
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人β-防御素DEFB113的重组表达及活性鉴定
DEFB113为人β-防御素家族新成员,其生物学功能尚不清楚.为了探索一种可以较低成本和较高产量表达活性DEFB113多肽的方法,将编码DEFB113成熟肽的序列克隆到载体pTWIN1上,并转化至E.coliBL21 (DE3)中进行表达.结果表明融合蛋白主要以可溶形式存在；重组载体中融合标签的几丁质结合域(CBD)和内含肽(intein)分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成.终得到DEFB113多肽的产率为6～7 mg/LLB.经活性鉴定,该重组DEFB113多肽对于S.aureus,E.coli K12D31和C.albicans均表现出较强的抑制作用；另外DEFB113无明显的溶血活性,是一种较理想的多肽抗生素.该研究为进一步研究DEFB113的生理功能以及其它人β-防御素结构与功能奠定了基础.
关键词： 原核表达 载体pTWIN1 人β-防御素DEFB113 抑菌活性 溶血活性
