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食源性金黄色葡萄球菌溶血素基因的多重PCR检测和聚类分析
目的 建立多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌α-溶血素、β-溶血素、h-溶血素基因以及16S rDNA,了解食源性金黄色葡萄球菌中3种溶血素基因的分布情况和溶血表型,并对菌株进行聚类分析.方法 建立多重PCR方法检测148株食源性金黄色葡萄球菌的hla、hlb和hemolysin基因,并研究其分布情况,同时用血平板法检验其溶血表型,对数据进行汇总分析.结果 148株菌中131株检出hla基因(88.51％),90株菌检出hlb基因(60.81％),28株菌检出hemolysin基因(18.92％)；表型溶血的有131株(88.51％),不溶血的有17株(11.49％)；以溶血素基因型和溶血表型为聚类因素,将148株菌以100％相似度为界分为A～L共12个型,其中以A型为主,有58株(39.19％),B型37株(25.00％),C型18株(12.16％).结论 该四重PCR方法特异性高,快速简便,能满足高通量菌株筛选的要求；食源性金黄色葡萄球菌普遍携带hla基因,聚类分析以A型和B型为主.
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金黄色葡萄球菌β-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备
目的 利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌外分泌毒素β-溶血素(β-hemolysin , Hlb )及其突变体HlbH-149-N ,检测其生物学活性,并制备其功能性抗体,探讨Hlb蛋白在金葡菌感染中的生物学意义. 方法 以金葡菌NCTC-8325基因组为模板,利用PCR技术扩增目的基因hlb,进一步构建重组表达载体pET28a-hlb,并转至大肠杆菌BL21(DE3),利用点突变技术构建重组表达载体pET28a-hlbH-149-N,经IPTG诱导表达目的蛋白,通过Ni2+柱亲和纯化获得Hlb蛋白及突变体HlbH-149-N蛋白;通过溶血实验检测Hlb及突变体HlbH-149-N蛋白的生物学活性,并制备Hlb特异性抗体,检测抗体的中和活性. 结果 获得了纯度较高的重组Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白,溶血活性实验结果表明,重组Hlb蛋白能够裂解绵羊红细胞,而突变体HlbH-149-N蛋白不能裂解绵羊红细胞;不同物种红细胞对Hlb敏感性不同;制备了抗Hlb蛋白的多克隆抗体(anti-Hlb),ELISA和Western印迹实验结果表明,anti-Hlb能特异结合Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白,同时发现,anti-Hlb可有效抑制Hlb对绵羊红细胞的裂解作用. 结论 获得了具有良好溶血活性的重组Hlb蛋白以及无溶血活性的突变体HlbH-149-N蛋白,并制备了具有中和活性的特异性抗体,为深入研究Hlb在金葡菌致病过程中的作用奠定了基础.
