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食源性金黄色葡萄球菌溶血素基因的多重PCR检测和聚类分析
目的 建立多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌α-溶血素、β-溶血素、h-溶血素基因以及16S rDNA,了解食源性金黄色葡萄球菌中3种溶血素基因的分布情况和溶血表型,并对菌株进行聚类分析.方法 建立多重PCR方法检测148株食源性金黄色葡萄球菌的hla、hlb和hemolysin基因,并研究其分布情况,同时用血平板法检验其溶血表型,对数据进行汇总分析.结果 148株菌中131株检出hla基因(88.51％),90株菌检出hlb基因(60.81％),28株菌检出hemolysin基因(18.92％)；表型溶血的有131株(88.51％),不溶血的有17株(11.49％)；以溶血素基因型和溶血表型为聚类因素,将148株菌以100％相似度为界分为A～L共12个型,其中以A型为主,有58株(39.19％),B型37株(25.00％),C型18株(12.16％).结论 该四重PCR方法特异性高,快速简便,能满足高通量菌株筛选的要求；食源性金黄色葡萄球菌普遍携带hla基因,聚类分析以A型和B型为主.
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金黄色葡萄球菌α-溶血素的研究进展
金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)分泌多种与致病相关的毒素,α-溶血素是其中主要的一种,它被认为是金葡菌感染引起皮肤坏死和严重感染的主要毒力因子.α-溶血素的名称来源于其能够溶解红细胞的特性,但是其细胞特异性范围很广,作用机制也十分复杂,对不同的宿主细胞所引发的致病反应也各不相同.本文总结了近年来有关α-溶血素结构及其与不同宿主细胞相互作用的研究,以利于我们更好地理解α-溶血素在金葡菌感染过程中所发挥的作用,为开辟金葡菌感染防治的新途径提供参考.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关致病因子的检测
目的 了解医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) (HA-MRSA)和社区相关性MRSA (CA-MRSA)的相关致病因子及其分布规律,为医院关于MRSA的感染学控制提供相关依据.方法 收集2010年1月-2011年12月医院门诊和住院患者分离的53株MRSA,应用聚合酶链反应技术(PCR)检测MRSA中杀白细胞毒素(PVL)及α-溶血素(α-HL).结果 临床分离的53株MRSA中,PVL毒素15株CA-MRSA中5株阳性,阳性率为33.3％,38株HA-MRSA中1株阳性,阳性率为2.6％,(P≤0.05)；15株CA-MRSA进行α-溶血素检测,其中9株阳性,阳性率为60.0％；38株HA-MRSA,其中23株阳性,阳性率为60.5％ (P＞0.05).结论 PVL毒素和α-溶血素是MRSA主要的致病因子,在携带率方面,CA-MRSA比HA-MRSA更容易携带PVL毒素,差异有统计学意义；而α-溶血素在两者之间差异无统计学意义.
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金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备
目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）重要的外分泌毒力因子α-溶血素（alpha hemolysin， Hla），检测Hla蛋白对不同种属红细胞的裂解作用；制备其特异性抗体，并检测抗体的中和活性。方法以SAU NCTC-8325菌株基因组为模板，PCR扩增hla基因，构建重组表达载体pET-28a-Hla，转化大肠杆菌BL21（DE3），利用IPTG诱导表达，通过Ni2＋柱亲和纯化获得Hla蛋白；通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性。结果重组Hla蛋白以可溶形式表达，细胞裂解实验表明，纯化的Hla蛋白可以显著裂解兔红细胞，但人红细胞和羊红细胞对Hla杀伤作用不敏感。 ELISA结果表明，获得了效价较高的多克隆抗体。该抗体可以有效抑制Hla对兔红细胞的裂解作用。结论 SAU的Hla蛋白对不同种属红细胞的溶解能力不同，为探讨Hla裂解细胞的机制给予一定的提示；同时所制备的特异性抗体（ anti-Hla）可以抑制Hla的溶血作用，为深入研究Hla的致病机制奠定了基础。
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金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性
目的 原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性.方法 采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒pET28a-hlaH35L.将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用.结果 重组表达质粒pET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒pET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符.表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50％,纯化后纯度均在90％以上.Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg; HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用.结论 成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础.
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芦荟苷对金黄色葡萄球菌生长抑制作用及对溶血毒素表达的影响
目的 研究芦荟苷体外对金黄色葡萄球菌生长抑制作用以及对溶血素表达的影响.方法 采用肉汤倍比稀释法检测芦荟苷水溶物对金黄色葡萄球菌低抑菌浓度(MIC);琼脂打孔法观察芦荟苷对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小;试管法检测芦荟苷作用下金黄色葡萄球菌凝固酶的产生变化;检测芦荟苷作用下金黄色葡萄球菌溶血素活性变化;采用实时荧光定量PCR检测芦荟苷水溶物作用于金黄色葡萄球菌后对hla和agrA基因表达的影响.结果 芦荟苷水溶物可抑制金黄色葡萄球菌生长并呈现浓度依赖性,作用于ATCC 25923和临床菌株SA1.5后的抑菌圈直径和MIC分别为21.5 mm、12.5 mg/mL和17mm、15 mg/mL;与对照组凝固酶效价32比较,1/2MIC组、MIC和2MIC组芦荟苷作用ATCC 25923后的凝固酶效价分别降为16、4和2;与对照组相比,1/2MIC组、MIC组及2MIC组芦荟苷水溶物降低ATCC 25923溶血活性,溶血率分别为(77.4±3.41)％、(42.2±2.4)％和(38.7±2.4)％;1/2MIC组、MIC组和2MIC组芦荟苷作用ATCC 25923后hla表达量分别为0.020 3(0.019 6,0.028 8)、0.011 6(0.010 6,0.013 1)和0.033 7(0.020 2,0.042 9),3组间差异有统计学意义(H=16.807,P＜0.05);agrA表达量分别为0.074 6(0.066 2,0.098 2)、0.020 8(0.012 2,0.032 6)和0.021 3(0.010 2,0.029 6),3组间差异有统计学意义(H=16.320,P＜0.05).结论 芦荟苷可抑制金黄色葡萄球菌生长,并对α-溶血素表达有抑制作用.
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金黄色葡萄球菌α-溶血素突变体H35A抑制α-溶血素的细胞毒性
目的:研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hemolysin,Hla)突变体H35A在人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cells,hPBMC)和THP-1巨噬细胞中对于野生型Hla毒性作用的影响.方法:H35A与Hla共同作用于hPBMC和THP-1巨噬细胞,实时荧光定量PCR检测细胞中白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎症因子的mRNA转录水平差异,台盼蓝染色计算THP-1巨噬细胞存活率.结果:预孵育突变体H35A 1 h的hPBMC和THP-1巨噬细胞,经Hla刺激产生IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA转录水平显著降低;台盼蓝染色计数发现,H35A与Hla共同作用的THP-1巨噬细胞存活率显著高于Hla单独处理组.结论:突变体H35A可抑制野生型Hla对于hPBMC和巨噬细胞的毒性作用,为金黄色葡萄球菌早期感染防治药物的研发提供了更多选择.
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金黄色葡萄球菌α-溶血素基因表达及溶血活性检测
目的 为了进一步研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α-溶血素(Hla)的分子致病机理及其抗原性,对S. aureus Hla进行了表达纯化.方法 用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S. aureus wood46株中扩增出hla 基因,将该基因经BamHI和SalI双酶切后克隆到表达载体PET-32a中,获得重组质粒pET-32a(+)/hla,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,然后进行纯化和用溶血试验检测其活性.结果 扩增的hla基因序列与已发表的hla基因序列同源性为100%,构建的重组表达质粒pET-32a(+)/hla在E. coli BL21(DE3)中得到表达,重组α-溶血素蛋白为53kDa,纯化后的溶血活性为5000HU.结论 成功表达并获得了有活性的重组Hla蛋白.
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一种平面脂质双分子层电生理平台的循环水浴温控模块搭建方法
目的:单通道平面脂质双分子层电生理平台是目前研究离子通道特性直接、有效的技术手段.为扩展平台研究温度对离子通道电生理特性、通道稳定性等的研究的能力,本文借助循环水浴对平台的温控模块进行设计与实现.方法:本文以Warner公司的脂质双分子层电生理实验平台为操作平台搭建循环水浴温控模块.通过分析温控模块中循环水对平台电流测量的干扰并比较不同循环水排布方式对电流测量的干扰强度,我们设计了折返对偶排布的循环水排布回路,并借助α-溶血素七聚体大孔径离子通道检验该设计的实用效果.该排布方式能够降低循环水回路与电流测量回路间的电磁耦合,进而降低由循环水引入的电磁干扰,保证皮安级小电流的测量.结果:电流噪音可受循环水流回路的排布影响,其中在采用折返对偶排布的情况下,电流噪音与无温控系统空白对照的电流噪音无显著区别.结论:折返对偶排布的循环水流设计能够有效降低循环水温控模块对电流测量的电磁干扰.
