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利用实时荧光定量PCR技术快速诊断唐氏综合征的研究
目的:建立实时荧光定量聚合酶链反应( RT - qPCR)技术,快速诊断唐氏综合征.方法:应用RT - qPCR方法同时扩增位于21号染色体上的唐氏综合征特异区域基因片段( DSCR3)和12号染色体上的磷酸甘油醛脱氢酶基因,根据相对定量指标△CT值区分唐氏综合征患者和正常人.结果:正常人组和唐氏综合征患者组△CT值差异有统计学意义(P＜0.001),且无交叉重叠.结论:RT-q PCR技术快速诊断唐氏综合征方法可行,具有简单、快速、特异性高等特点.
关键词： 唐氏综合征 实时荧光定量聚合酶链反应 相对定量 快速诊断 -
相对定量四色流式细胞术分析正常B淋巴细胞发育成熟过程中的抗原表达规律
流式细胞术因其高度的灵敏性(10～4水平)和可进行多参数分析而成为检测白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)的重要工具.在B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)MRD检测中的作用更是不容忽视.但是由于白血病细胞表达的多样性和个体差异性,以及治疗过程中相当一部分病例会出现肿瘤细胞表达标志改变,尤其是化疗后骨髓中存在大量正常增生的幼稚B淋巴细胞,使MRD的检测难度加大.使用相对定量流式细胞术检测正常B淋巴细胞发育成熟过程中的抗原表达规律,有助于鉴别幼稚B淋巴细胞与MRD,提高MRD的检测灵敏度.
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肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法
我们曾和美国马利兰大学发展了鉴定肠出血性大肠埃希杆菌的探针，其特异性和灵敏性极高。经序列分析发现该探针是溶血素基因的部分片段。我们又从溶血表型进一步完善了这一鉴定方法。由于其溶血条件特殊，人们一直认为该菌不溶血。我们将经验总结报告如下。 一、材料和方法 1．菌种来源：肠出血性大肠埃希杆菌882364，1986年江苏省徐州市卫生防疫站分离，经本实验室鉴定，并保存。851006为本实验室筛选到的溶血素基因的天然缺失株（对照菌株）。 2．菌株鉴定：生化鉴定为大肠埃希菌。O157单抗和H7血清为本实验室制备。用O157：H7 PCR诊断试剂盒检测882364、851006的溶血素基因，882364的扩增结果为阳性，851006为阴性。 3. 血平板的制备［1］：脱纤维羊血用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入至终浓度为3%。培养条件：于混合气（8%CO2，40%H2，52%N2）环境中37℃培养16 h，然后置21℃空气中6 h。 4．液体溶血活性检测［2］：(1)标准1%羊红细胞的制备；(2)活化菌体；(3)活性检测。 二、结果血平板检测的结果需对光观察，如发生溶血，可见菌落周围透明溶血环。液体溶血检测的结果如只需定性，则A值大于完全不溶血管即可；如需相对定量，可用溶血单位（HU）表示，一个溶血单位(HU)为裂解50%羊红细胞的检测样品的量。
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大鼠肠巨噬细胞TNFα表达及复方大承气汤的影响
目的:探讨体外培养的肠巨噬细胞分泌TNFα的规律及地塞米松、TNFα单克隆抗体及复方大承气汤对LPS诱导的肠巨噬细胞TNFα产生的影响.方法:体外分离培养大鼠肠巨噬细胞.设对照组、脂多糖组、地塞米松处理组、TNFα单抗处理组和复方大承气汤处理组.每组分别在3 h,6 h,12 h和24 h取上清液,用放免法检测TNFα浓度.并分别收集肠巨噬细胞,提取RNA,采用RT-PCR法相对定量TNFαmRNA.结果:肠巨噬细胞经脂多糖(LPS)诱导后,各时相TNFα分泌及TNFmRNA表达均明显增加;地塞米松、TNFα单克隆抗体及复方大承气汤处理后,各时相TNFα分泌都较脂多糖(LPS)诱导组显著下降,各处理组TNFα mRNA表达在3h时与脂多糖(LPS)诱导组比较无明显差异,6h、12h、24 h,地塞米松、复方大承气汤处理组显著降低,而TNFα单克隆抗体处理组无明显差异.结论:LPS是肠巨噬细胞分泌TNFα的有效激活剂,地塞米松、复方大承气汤能从蛋白质及核酸水平抑制TNFα的产生,而TNFα单克隆抗体只能从蛋白质水平抑制TNFα的产生.
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磁共振波谱在胶质瘤诊治中的应用
磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy,MRS)是利用化学位移原理测定人体内化合物的一种非损伤技术.可以测定脑组织或肿瘤组织能量代谢、神经元损坏、细胞膜增殖及坏死转换等不同的信息,实现对病变的定性甚至定量诊断,是胶质瘤诊治的有力工具[1].一、MRS的基本原理及技术处于不同分子中的同一种磁性原子核,因分子结构差异,磁性原子核受到电子云的屏蔽作用不同,在外加磁场的作用下原子核会表现出迸动频率的差异,这种现象称为化学位移现象.MRS利用化学位移的微小变化采集信息,通过放大增益并经傅立叶变换转为MRS.不同化合物中原子核的进动频率在MRS中的位置以百万分几(parts per million,ppm)为单位来描述.其含量和代表该化合物波谱的曲线下面积呈正比.化合物浓度可用相对定量和绝对定量表示.
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相对定量检测HIV/AIDS病人PBMCs中TIGIT mRNA表达水平的方法建立
目的 建立检测人外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)信使核糖核酸(mRNA)表达水平的相对定量方法,并探讨TIGIT在艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)病人(简称HIV/AIDS病人)临床监测中的意义.方法 设计基因TIGIT引物3对,并利用超声波-煮沸法提取人PBMCs总RNA,选用管家基因GAPDH作为内参,然后用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行反转录及扩增TIGIT基因.利用软件测定电泳条带的灰度值(IOD),计算TIGIT mRNA的相对表达量.结果 超声波-煮沸法提取的RNA纯度(A260/A280=1.71±0.056)优于超声波法(A260/A280=1.51±0.023)和煮沸法(A260/A280=1.375±0.078);筛选出扩增条带清晰且单一的TIGIT引物;相对定量结果表明,TIGIT mRNA在HIV/AIDS病人中的相对表达量均数(0.520 4±0.067)显著低于健康人群(1.383±0.093),差异有统计学意义(t=7.206,P=0.0167).结论 所建立的相对定量RT-PCR检测方法具有成本低、简单易行的优点,可应用于检测HIV/AIDS病人外周血中TIGIT mRNA的表达差异.
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p16抑制基因在腮腺多形性腺瘤中表达的定量分析及临床意义
p16基因是细胞周期的调控者,与许多肿瘤的形成和发展关系密切.我们利用计算机图像处理系统,对p16基因在腮腺多形性腺瘤中的蛋白表达相对定量,探讨其在腮腺多形性腺瘤发生、发展中的作用.
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一种简便、高效的实时荧光PCR相对定量方法的建立
目的 建立一种简便、高效的实时荧光PCR相对定量方法.方法 采用严格一致的引物参数,对Fabp5、Ppar-α及β-Actin三个基因分别设计特异性扩增引物,制备相应的质粒标准品,10倍梯度稀释后制作标准曲线.并以这三个标准曲线分别单独定量正常小鼠肝组织、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤周围组织和肿瘤组织中的Fabp5、Ppar-α和β-Actin的表达水平,以β-Actin为内参,分别采用双标准曲线法、2-ΔΔCt法和单标准曲线法对Fabp5和Ppar-α的表达进行相对定量分析.结果 单标准曲线法与双标准曲线法测定的Fabp5和Ppar-α差异性表达的相对定量值没有显著差异,而用2-ΔΔCt法获得的相对定量值与双标准曲线法相比,波动较大.结论 在引物参数严格一致的基础上,单标准曲线法是一种可行、简便、高效的实时荧光PCR相对定量方法.
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磁共振波谱定量颅内肿瘤代谢物的方法及技术
氢质子磁共振波谱(1H-MRS)分析是一种检测体内组织、细胞生化代谢水平的无创性方法,它在颅内肿瘤的早期诊断、准确分期中有着重要价值.尤其是当一些因素(如合并有放射治疗后改变等)使常规磁共振成像诊断的准确性降低时,1H-MRS提供的代谢信息能提高对肿瘤残存和复发的诊断准确性,有待逐渐成为颅内占位性病变常规检查的一部分.该文对1H-MRS定量颅内肿瘤代谢物的方法及技术予以综述.
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人单个中性粒细胞IL-8RβmRNA丰度的相对半定量研究
目的:探讨单个中性粒细胞中白介素-8β型受体(IL-8Rβ)mRNA的表达丰度.方法:采用倍比稀释相对定量单细胞RT-PCR方法分离纯化人外周血中性粒细胞并提取总RNA,针对IL-8RβmRNA设计引物,进行RT-PCR确认IL-8Rβ在中性粒细胞中的基因表达并优化反应条件.收集单个中性粒细胞胞内容物或完整细胞,以相同引物进行RT反应,再将后者所得的cDNA倍比稀释后,与前者共同经过两轮PCR扩增,并将终产物以BamHI内切酶酶切鉴定产物的特异性.结果:IL-8RβmRNA在人中性粒细胞中有大量表达,单个中性粒细胞中亦能扩增出特异性的IL-8Rβ目的条带,并且将单个细胞内mRNA稀释104倍后仍可扩增出目的条带,BamHI内切酶酶切反应证实为目的产物.结论:人中性粒细胞表达IL-8RβmRNA,mRNA倍比稀释单细胞RT-PCR方法确认其丰度远高于一般mRNA含量,且此方法可在单细胞水平比较细胞内mRNA的丰度.
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髋膝关节置换术后疗效评估体系
术后疗效评估体系是通过对影响手术效果的诸多因素和患者术后主观和客观功能恢复情况的考评,形成一个对手术疗效综合评价的相对定量的评定系统,是衡量手术成功与否和进行随访研究的重要科学依据.人工关节置换术的疗效由于受手术前致病原因、关节结构毁损程度、关节假体的类型、假体的固定方式、手术技术以及手术后康复情况等诸多因素的影响,要进行关节置换手术整体水平评估,不同的假体系统之间和各手术个体之间的疗效比较,以及个体手术疗效的稳定性随访,拥有一个标准、完善和为大家共同接受的术后疗效评定体系尤为重要.
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低丰度基因Real-time PCR相对定量方法的建立
低丰度基因通常难以通过标准曲线法进行Real-time PCR.通过使用特异引物,对拟南芥低丰度表达基因CIPK7进行了转录水平上的定量分析,成功建立了可检测低丰度基因表达变化的Real-time PCR标准曲线定量方法.扩增CIPK7基因CDS全长,并对PCR产物进行纯化,使用纯化的PCR产物作为标准品,绘制标准曲线,对CIPK7基因的表达进行Real-time PCR分析.与常规Real-time PCR方法进行比较,结果表明,该方法得到的标准曲线,浓度区间范围广,线性关系好,能够很好地适用于低丰度基因的Real-time PCR标准曲线法定量.实验测得低温胁迫下拟南芥CIPK7基因的表达量,随低温处理时间增长,有明显的先升高后降低的变化.
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荧光实时定量PCR的研究进展
生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定.基因表达差异终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡.定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容.
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实时荧光定量PCR的三种数据分析方法比较
目的 比较实时荧光定量PCR的三种数据分析方法(2-△△CT、REST2009 和REST MCS) 的异同.方法 以正常小鼠来源的cDNA 混合物阳性对照为模板,5 倍系列稀释,分别做miRNA-181a 和Sn RNA U6 的标准曲线.实时荧光定量PCR检测正常组和哮喘组小鼠脾脏CD4+T 细胞miRNA-181a和Sn RNA U6 表达水平,以Sn RNA U6 为内参基因,采用2-△△CT、REST2009 和REST MCS 方法,对正常组和哮喘组miRNA-181a 进行相对定量分析.结果 5倍系列稀释法制作的标准曲线提示miRNA-181a 和Sn RNA U6 基因扩增效率分别为99.8%和99.9%,采用2-△△CT提示,REST2009 软件分析,RESTMCS 软件分析,皆表明哮喘组miRNA-181a 的表达量为正常组的2.92 倍,但是三种方法在适用条件、分析数据的多少等方面存在一定的区别.结论 三种数据分析方法各有特点,可根据研究者本人的实验要求选择合适的方法.
关键词： 实时荧光定量聚合酶链式反应 相对定量 标准曲线 微小RNA -
PCR定量技术在医学上的应用及其方法学评估
PCR技术早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式.如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等.基因定量检测已经成为研究遗传性疾病、感染性疾病以及某些易感基因引起的疾病的重要手段.
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人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立
目的:建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法.方法:依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物,以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版,以TBP基因为参照基因,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达.结果:POT1和TBP基因熔解曲线为单峰,无杂峰及二聚体.POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同(直线斜率0.0171＜0.1).POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3%和2.1%;TBP基因批内变异与批问变异分别为1.2%和2.6%.结论:建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法,该方法简单快速,经济,灵敏度高,特异性和重复性好,可用于人类POT1基因的定量分析.
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实时RT-PCR基因表达相对定量REST(C)软件分析与2(-△△CT)法比较
目的 利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法.方法 以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线.以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR.以GAPDH基因作为内参照.进行POLK基因表达相对定量.实验数据分别采用2(-△△CT)法及REST(C)软件分析.结果 5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq 0.997).POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%.采用2(-△△CT)法计算出的表达比值均比REST(C)软件分析高.结论 实时RT-PCR技术结合REST(C)软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段.
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两种分析miRNA相对表达量方法的比较研究
目的：基于实时反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）基因表达相对定量的分析方法：GenEx软件分析与2（-ΔΔCT）法，建立一种简便、准确的miRNA相对定量方法。方法以 HK-2细胞系 cDNA 为模板，进行PCR扩增，确定佳退火温度；再倍比稀释该模板，用荧光定量PCR测定的Ct值作miR-122和miR-16的标准曲线，计算出相应miRNA的扩增效率。用荧光定量PCR测定健康者和乙型肝炎患者血清中内参miR-16和靶基因miR-122的表达，分别采用GenEx软件分析与2（-ΔΔCT）法来评价相对表达量。结果系列稀释法制作的标准曲线呈现较好的线性相关性，两种 miRNA 的标准曲线 r2值均为0．999，miR-16的扩增效率为97％，miR-122扩增效率为107％。2（-ΔΔCT）法分析乙型肝炎患者血清中miR-122的表达较健康者增高了44．3倍，而GenEx软件分析为54．1倍。结论GenEx 软件分析考虑了更多的影响因素，其结果比2（-ΔΔCT）法更可靠，适用于临床分析。
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检测细胞间粘附分子-1对原发性肝癌的诊断意义
1. 资料与方法：患者血清标本-80℃保存，HCC44例，LC30例，健康献血员30例。组织标本：经病理证实的HCC标本35例，正常肝组织6例。smICAM-1检测用免疫组织化学结合多媒体彩色病理图文分析系统分析，ICAM-1用相对定量，即ICAM-1量＝（样品灰度－本底灰度）×样品面积。血清sICAM-1应用ELISA法检测。统计学分析用ｔ检验及直线相关分析。 ? 2. sICAM-1测检的结果：(1)LC组（242.3±96.1）U/ml与HCC组（286.4±83.4）U/ml sICAM-1水平均明显高于正常对照组（90.6±39.7）U/ml（P＜0.01＝，HCC组sICAM-1水平高于LC组（P＜0.05＝。
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实时荧光定量PCR在脊髓性肌萎缩症基因检测中的临床应用
目的 验证实时荧光定量PCR在脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)基因检测中的可靠性,建立临床检验操作质量控制方法.方法 对经多重连接依赖探针扩增方法分型的35例SMA患者,61例一级亲属,61位无SMA家族史健康体检者及7份产前诊断样本,分别在Roche LightCycler(R)480及Bio-Rad CFX96TM两款实时荧光定量PCR仪器上完成SMN1基因第7外显子拷贝数的相对定量检测.结果 所有样本SMN1拷贝数相对定量检测结果与多重连接依赖探针扩增方法一致,两个定量PCR平台均可准确区分不同SMN1拷贝数,但数据存在系统差异.结论 实时荧光定量PCR法检测SMA携带者的可靠性有赖于规范的质量控制,不同检测平台及体系需预设标准样本数据库.
