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血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤骨髓/外周血瘤细胞免疫表型分析
血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)是一类以异形T淋巴细胞增生伴显著血管增生,以及滤泡树突状细胞增生为主要表现,为一类来源于成熟T细胞的淋巴瘤[1].过去AITL瘤细胞形态学诊断缺乏特异性的鉴别特征,而近来AITL瘤细胞CD10[2]和CXCL13表达意义的发现为AITL的诊断提供了有力的支持,为了更深入了解AITL瘤细胞的免疫表型特征及发病机制,我们利用流式细胞术分析AITL患者骨髓及外周血有核细胞表面CD分子标志,期望获得更多信息.
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用流式细胞术分析1例无关脐血移植后的免疫重建
脐血移植后的早期免疫重建不仅受到移植脐血状况和移植时患者状态的影响,而且与GVHD、感染、免疫抑制剂及G-CSF、GM-CSF的使用都有着重要的关系。我们利用流式细胞术,研究了国内罕见的4岁急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿HLA 2个位点不相合的无关脐血移植后3个月免疫重建的过程。 患儿,男,4岁,体重14.5kg,血型为AB型,ALL,第二次完全缓解(CR)。经搜寻,供者编号980229,移植脐血48ml,有核细胞数25.9×107/kg,血型O型。HLA配型采用BU/CY/ATG预处理方案。移植脐血样本于42℃水中快速复温,通过中心静脉输注,有核细胞回收率85%,活率80%,CD34+细胞5.014×107/kg,CFU-GM 8.319×105/kg。使用环孢霉
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相对定量四色流式细胞术分析正常B淋巴细胞发育成熟过程中的抗原表达规律
流式细胞术因其高度的灵敏性(10~4水平)和可进行多参数分析而成为检测白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)的重要工具.在B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)MRD检测中的作用更是不容忽视.但是由于白血病细胞表达的多样性和个体差异性,以及治疗过程中相当一部分病例会出现肿瘤细胞表达标志改变,尤其是化疗后骨髓中存在大量正常增生的幼稚B淋巴细胞,使MRD的检测难度加大.使用相对定量流式细胞术检测正常B淋巴细胞发育成熟过程中的抗原表达规律,有助于鉴别幼稚B淋巴细胞与MRD,提高MRD的检测灵敏度.
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足月新生儿与健康成人T淋巴细胞亚群比较分析
T淋巴细胞亚群测定对监测和评价机体细胞免疫功能有重要意义.目前国内新生儿T淋巴细胞亚群表达的有关报道较少.本研究用流式细胞术分析新生儿T淋巴细胞亚群表达情况,并与不同年龄组的正常成人进行比较分析.
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丹参酸乙的抗氧化作用对大鼠肝星状细胞增生的影响
目的:研究丹参酸乙(salvianolic acid B,SAB)的抗氧化作用对大鼠肝星状细胞(hepatic stallate cells,HSC)增生周期的影响.方法:采用原位灌注法消化大鼠肝脏,108g@L-1nycodenz密度梯度离心,分离肝星状细胞,分别以不同浓度的SAB或MDA/SAB处理细胞,3H-TdR掺入法观察细胞的增生能力,流式细胞术分析细胞周期各时相变化及凋亡情况.结果:1和10 tanol@L1SAB可显著抑制HSC的增生(2862±123M&2988±407 vs 4986±727,P<0.05,P<0.01),这种作用主要是抑制了细胞周期过程中G期向S期的过渡;1和10 pmol@L1SAB均可抑制MDA刺激的HSC增生(3067±73l&3042±321vs4007±587,P<0.05,P<0.01);两组剂量的SAB均不促进HSC的凋亡.结论:丹参酸乙可抑制体外培养HSC的增生,这种抑制作用与SAB的抗氧化作用有一定的关系.
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奥曲肽抑制人胃癌细胞株MKN45的生长
目的:研究奥曲肽(octreoticde,OCT)对人胃癌细胞株MKN45生长的调控作用,并探讨其作用机制.方法:采用MTT比色分析法测定OCT 10-2,10-3,10-4,10-5,10-6g.L-1对MKN45细胞生长的调控作用;采用流式细胞术分析OCT 10-3g·L-1对MKN45细胞的周期分布的影响.结果:OCT 10-2,10-3,10-4g·L-1对MKN45细胞的生长均有抑制作用,以10-3g·L-1浓度的抑制作用显著,为10.4%;10-3g·L-1这一浓度可诱导MKN45出现G0/GI阻滞,于加入OCT后6h开始,为(64±4)%,24h显著,达(75±3)%,36h已消失;与对照组(7±1)%相比,24h G2/M期细胞比例亦减少,为(2±2)%,但OCT未改变亚二倍体细胞的比例.结论:OCT可抑制人胃癌细胞株MKN45的生长,其作用机制之一是诱导细胞出现GO/GI阻滞.
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乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
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bFGF对人肝癌细胞系Bel-7402的生长调控
目的:探讨bFGF是否通过PI3K/PKB途径调节p21WAP1的表达.方法:32P掺入法检测PKB酶活性,RT-PCR、Western blot检测不同处理组Bel-7402细胞的p21WAF1表达,流式细胞术分析细胞周期.结果:25 μg/LbFGF刺激细胞10 min,就可使胞液和膜性PKB酶活性达高峰.p21WAF1mRNA表达水平在1 h达高峰,比对照升高了5.5倍.p21WAF1蛋白表达在2 h达高峰,比对照升高了2.2倍.wortmannin预处理后,PKB活性在各时间点均明显降低(P<0.05),p21WAF1mRNA表达及p21WAF1蛋白表达无明显变化.流式细胞术分析显示,bFGF处理组与对照组相比G1期细胞减少(0.65±0.01→0.49±0.02,P<0.01),S期细胞增多(0.14±0.01→0.28±0.01,P<0.01),worrtmannin能抑制此促增生作用(G1:0.58±0.01;S:0.22±0.01,P<0.01).结论:PI3K/PKB途径可介导bFGF对Bel-7402细胞的促增生作用,但是bFGF对p21WAF1表达的调节作用不依赖PI3K/PKB途径.
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格尔德霉素对肝癌细胞Akt磷酸化及细胞周期的影响
目的:研究热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素(geldanamycin,GA)对肝癌细胞生长的影响并探讨相关机制.方法:用MTT法检测药物对肝癌HepG2细胞的生长抑制作用,并用流式细胞术分析细胞周期与凋亡状况.Western印记杂交法检测细胞内蛋白激酶B/AKT磷酸化状态的变化.结果:400μmoL/L浓度的GA处理细胞后,HepG2细胞胞内磷酸化AKT的水平明显下降(24 h为对照组66.03%,48h为对照组34.02%);GA作用后细胞呈现G2/M期阻滞并伴有凋亡率增加;同时MTT法显示GA对HepG2细胞有生长抑制作用,用药时间越长抑制率越高,24h和48h的抑制率分别为4.09%和21.74%.结论:通过GA抑制Hsp90的功能能够抑制肝癌细胞的生长并促进其凋亡,这一效应与信号传导系统活化状态的改变有关.
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TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响
目的:TGIF(TGinteractingfactor)是TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制分子,且MAPK通路的活化能延长其半衰期,但他在肿瘤发生中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响.方法:将TGIF反义寡核酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测转染效率,MTT法检测胃癌细胞的增生速度,流式细胞术分析转染细胞的细胞周期和凋亡率的变化.结果:SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后,细胞增生受到部分抑制,72h后,他的抑制率达20.4%,但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变.TGF-β1处理后,与突变寡核苷酸转染组细胞和未转染组细胞相比,TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制(30%),G1期细胞含量增加更明显.结论:TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用,多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1,这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF,抑制TGF-β对自身的生长抑制作用,从而促进肿瘤的发生、发展与转移.
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小儿白血病凋亡的流式细胞术分析及Bcl-2蛋白表达的研究
凋亡细胞百分比是流式细胞术(FCM)近年在白血病应用中新建立的一个测量指标.本研究即是应用FCM测定小儿白血病细胞的凋亡量并分析其与凋亡相关基因bcl-2表达间的关系.
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SF-3000细胞分析仪故障排除与维护
SF-3000血细胞分析仪使用半导体激光流式细胞术分析WBC.经试剂处理后的血细胞通过水路聚焦,被不含任何颗粒的鞘液包围成单行穿过Flowcell,受激光照射,产生散射光,通过检测散射光的强度和角度.对WBC进行分类和计数.
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不同骨髓检查在淋巴瘤诊断中的价值
目的:探讨3种骨髓检查方法(骨髓涂片、活检、流式细胞术分析)对淋巴瘤骨髓浸润的诊断及分期价值.方法:对74例患者进行3种方法的骨髓检查,评估不同方法的检出率、对分期的影响以及各亚型中骨髓浸润的风险.结果:骨髓涂片阳性者12例(16.2%),骨髓活检阳性10例(13.5%),流式细胞术分析阳性23例(31.1%),流式细胞术分析的阳性率显著高于涂片和活检检查(P<0.05);骨髓涂片、活检、流式细胞术分析可互相修正淋巴瘤患者的临床分期;弥漫大B细胞淋巴瘤亚型骨髓浸润比例高;对于无淋巴结、肝脾肿大者,骨髓检查具有明确诊断的作用.结论:骨髓涂片、活检及流式细胞术分析对淋巴瘤有重要的诊断及分期价值,三者互为补充,不能相互替代.
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应用流式细胞术分析去白细胞悬浮红细胞上清液不同存储期内微粒数量的变化
保存时间是库存血液制品的一个标签,也是输血领域里持续争论的热点问题。根据美国卫生与人类服务部(US DHHS)2011年发布的国家血液采集和使用调查报告(The 2009 National Blood Collection and Utilization Survey Report)[1],在美国境内输注的红细胞平均储存期为18.2 d。医院临床上给患者输注的红细胞保存时间一般在14 d以上。Tinmouth等[2]报道指出,输注了保存时间超过14 d的库存红细胞的患者出现并发症的概率明显比输注保存时间短(少于7 d)的红细胞的患者高。 Purdy等[3]的研究报道,在31个重症监护患者中,存活的12个患者输注过的红细胞平均保存时间为17 d,而死亡的19个患者输注过的红细胞平均保存时间为23 d。Koch等[4]发现输注保存超过2周的红细胞会明显增加术后并发症的发生概率,并提出将保存超过14 d的血液划分为旧血。在通常情况下,库存红细胞在储存过程中会发生一系列生物化学与结构上的改变,且随着储存时间的延长变化更加显著,这些改变通常被统称为红细胞的储存损伤[5]。细胞破损后而产生的细胞碎片及微粒会被释放到红细胞悬液的上清液中。据报道,这些细胞碎片及微粒具有免疫调节作用,与输血相关不良反应(炎症、血栓等)的发生密切相关[6,7]。因此,这些保存时间较长的红细胞,更容易引起输血相关不良反应的发生。为了解库存去白悬浮红的溶血情况及其溶血产物状态随存储时间的变化,我们在标准的血站采集、制备、运输和保存条件下,对不同保存期的库存去白悬浮红进行溶血情况及其溶血产物方面的系统研究。本文主要采用了流式细胞术来对库存去白悬浮红上清液中微粒数量进行检测,观察红细胞老化与溶血、细胞碎片生成等一系列变化。
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乳腺癌患者手术前后T淋巴细胞亚群变化的实验研究
肿瘤免疫学在近年来的肿瘤研究中起到主导地位,淋巴细胞作为机体免疫调节的重要组成成分,与肿瘤的发生发展具有密切关系.淋巴细胞亚群分析是当今机体免疫功能分析的重要手段[1].我国乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤的第二位[2],其生存率依然比较低[3].乳腺癌治疗也由单纯的局部治疗走向多学科有机结合的综合治疗.当前,关于乳腺癌与机体免疫功能的研究不断增多,本研究是基于流式细胞术分析乳腺癌患者手术前后T淋巴细胞亚群的变化,以探讨乳腺癌患者手术前后免疫功能变化与疾病发生发展及治疗之间的相互关系,为患者选择适当手术、放化疗、生物治疗等方法提供一定的参考依据.
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流式细胞术分析交变应力作用对植物细胞周期同步化的影响
应用流式细胞术分析烟草细胞在交变应力作用下细胞周期的变化.用特制的强声波发生装置发生频率和强度可调的交变应力场,研究不同频率和强度的交变应力作用后烟草细胞周期的变化.
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紫杉醇诱导Jurkat细胞凋亡及其机制探讨(摘要)
目的观察抗微管药物紫杉醇对T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat是否具有凋亡诱导作用,并进一步研究bcl-2基因家族在此过程中的作用。方法将不同浓度的紫杉醇作用于Jurkat细胞,观察其作用的时间效应及剂量效应;在光镜和电镜下观察其形态变化;用流式细胞术分析细胞DNA含量的改变并作DNA片段分析;用免疫组织化学及半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法观察在紫杉醇作用过程中凋亡调节基因bcl-2家族的mRNA和蛋白表达的变化。结果紫杉醇能抑制Jurkat细胞生长,在一定剂量和时间范围内,主要引起细胞凋亡,并显示剂量和时间效应,在这个过程中bax转录及蛋白表达增加,并出现bel-xs的转录。结论紫杉醇能特异地诱导Jurkat细胞凋亡,这为紫杉醇应用于T细胞淋巴瘤的治疗提供了依据,并为研究淋巴瘤细胞凋亡的基因调控提供了极好的模型,bax和bel-xs参与了紫杉醇诱导Jurkat细胞凋亡的基因调控。[全文刊登于中华血液学杂志2000,21(6):298]
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小鼠 CD4+CD25+调节性T细胞的分离纯化及鉴定
目的:调节性T细胞(Treg)是近年来免疫学研究的热点.文中研究获取高纯度Treg的方法及其表型的鉴定.方法:流式细胞术(FACS)分析正常小鼠脾脏中CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25-3个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(MACS)纯化小鼠脾细胞中CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定.结果:①依CD25表达水平不同将小鼠天然CD4+T细胞划分为3群,转录因子Foxp3、细胞毒T淋巴细胞相关分子-4( CTLA-4/CD152)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR )、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显著性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05).②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%~1.2%,纯度为87.29%~92.04%.FACS分析结果显示,Foxp3优先表达于CD4+CD25+T细胞亚群,表达率为(66.60±1.03) %,而在CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达,分别为( 23.97±2.00)%和(16.78±3.24%).CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达率为(77.37±1.67) %,明显高于在CD4+ 和CD4+CD25-T细胞亚群的表达[(21.97±2.39)%和(18.04±3.16)%].纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达.结论:MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可获得高纯度且具有天然CD4+CD25+ Treg细胞表型及功能特征的细胞.
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手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群变化的研究
手足口病(Hand-Foot-Mouth Disease, HFMD)是由20余种肠道病毒所致的急性传染病,多好发于5岁以下的婴幼儿,春夏季是本病的好发季节,常呈爆发流行,2008年被列为丙类传染病。手足口病患儿的临床表现以手足口臀等部位出现疱疹、丘疹为主,多伴随发热、皮肤溃疡等症状,还可出现心脏和脑组织损伤的并发症而导致死亡[1]。本研究应用流式细胞术分析手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群的变化,了解其免疫状况,探讨手足口病对机体免疫功能的影响。
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P物质对人粒细胞白血病细胞HL60及小鼠T淋巴白血病细胞L615生长的抑制作用
目的:探讨SP对肿瘤细胞系HL60及L615生长的影响.方法:将SP与两株肿瘤细胞共温育,用活细胞计数和MTT试验观察细胞生长趋势,并通过电镜观察、流式细胞术分析、G蛋白活性及PKC活性测定等方法探讨该作用的分子机制,后用动物体内实验验证经SP处理后细胞的致瘤性变化.结果:10-7~10-5 mol/L SP均可抑制HL60和L615细胞生长,活细胞计数测得的抑制率分别是17.01%±5.55%(n=6, P<0.05)和17.57%±5.38%(n=5, P<0.05);MTT试验测得的抑制率分别是13.89%±5.75%(n=6, P<0.05)和13.12%±11.56%(n=8, P<0.05).电镜结果表明SP可引起L615细胞凋亡,FCM结果显示实验组比对照组凋亡增加62.49%±27.00%(n=8, P<0.05).而HL60细胞无凋亡趋势.SP可使HL60和L615细胞系的PKC活性增加,分别为18.94%±4.19%(n=5, P<0.01)和16.40%±9.37%(n=4, P<0.05).SP与百日咳毒素共作用于细胞时,可拮抗后者的抑制作用,对HL60的抑制率降为2.92%±0.20%(n=6, P>0.05),表现为与对照无差异;对L615的抑制率大幅度降低至7.42%±5.01%(n=5, P<0.05),表明SP对G蛋白有激活作用.单抗HIM70可促进HL60细胞生长,增加率为11.01%±7.56%(n=7, P<0.01),与SP共作用时可拮抗SP的抑制作用,抑制率从24.69%±11.28%降至17.17%±8.48%(n=7, P<0.01).体内实验s结果显示经SP处理后的HL60细胞可使裸鼠肿瘤潜伏期延长4 d,且瘤块增长较慢,接种第10 d对照组与实验组瘤块分别为(111.35×111.35×111.35) mm、 0,第13 d两组分别为(335.78×335.78×335.78) mm、 (143.24×143.24×143.24) mm.处理后的L615细胞使实验组的615小鼠发病率降为0,而对照组的发病率为60%.结论:SP对两株肿瘤细胞的生长有抑制作用,其抑制机制在两株细胞可能不同,且SP对两株细胞系生长的抑制作用不同于直接杀伤性的细胞毒作用,而显示了SP作为调节分子的特性.