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NF-kB激活促进肝星状细胞的增殖
核转录因子kB(nuclear factor-kB,NF-kB)是一种重要的真核基因调节蛋白,对多种参与机体重要生理反应的基因表达起调控作用,这些反应包括免疫反应、急性炎症、细胞粘附、细胞分化和凋亡等,一些研究表明NF-kB有防止细胞凋亡的作用.但是,NF-kB对肝星状细胞增殖的调控作用尚未见报道.我们用国际公认的NF-kB抑制剂pyrrolidin-edithiocarbamate(PDTC)作用大鼠肝星状细胞,观察大鼠肝星状细胞的增殖状况.
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生长抑素对肝星状细胞的影响机制
目的:研究生长抑素(somatostatin,SST)与大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增生、凋亡的关系.方法:分离、培养的原代大鼠HSC,经不同浓度SST(10-6-10-10mol/L)处理72 h后,以吖啶橙(acridineorange,AO)/溴乙啶(ethidium bromide,EB)荧光染色法、末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、透射电镜及流式细胞术检测其凋亡率的改变.SST作用120 h后,以甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测HSC增生率的变化.并通过对细胞动力学的观察,探讨SST的作用机制.结果:SST可通过剂量依赖方式抑制HSC增生,提高HSC凋亡率.浓度为10-6mo1/L或10-7mol/L时效果尤为显著.Go/G1期阻滞是SST发挥作用的重要途径.结论:低剂量SST即可抑制HSC增生,并促进其凋亡,提示SST在抗肝纤维化方面具有潜在价值.
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丹参酸乙的抗氧化作用对大鼠肝星状细胞增生的影响
目的:研究丹参酸乙(salvianolic acid B,SAB)的抗氧化作用对大鼠肝星状细胞(hepatic stallate cells,HSC)增生周期的影响.方法:采用原位灌注法消化大鼠肝脏,108g@L-1nycodenz密度梯度离心,分离肝星状细胞,分别以不同浓度的SAB或MDA/SAB处理细胞,3H-TdR掺入法观察细胞的增生能力,流式细胞术分析细胞周期各时相变化及凋亡情况.结果:1和10 tanol@L1SAB可显著抑制HSC的增生(2862±123M&2988±407 vs 4986±727,P<0.05,P<0.01),这种作用主要是抑制了细胞周期过程中G期向S期的过渡;1和10 pmol@L1SAB均可抑制MDA刺激的HSC增生(3067±73l&3042±321vs4007±587,P<0.05,P<0.01);两组剂量的SAB均不促进HSC的凋亡.结论:丹参酸乙可抑制体外培养HSC的增生,这种抑制作用与SAB的抗氧化作用有一定的关系.
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永生大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定
目的:建立永生性大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)系.方法:采用改良胶原酶原位灌注法消化肝脏,经Nycodenz密度梯度离心分离、鉴定成年Sprague-Dawley大鼠的HSC.然后通过细胞克隆建立HSC系(HSC-PQ)并传代培养.结合细胞动力学、光镜、透射电镜及免疫细胞化学技术检测HSC-PQ系的倍增时间、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白表达、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成等表型特征.结果:分离获得的HSC约为2X107细胞/只大鼠,细胞成活率>95%,纯度>90%,培养2 wk后几乎所有HSC均已活化.在此基础上经细胞克隆所得的HSC-PQ系表型类似成纤维细胞,倍增时间约75 h,可表达结蛋白、α-SMA以及除Ⅳ型胶原外的多种ECM成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等),且传代过程中增生、ECM表达等特性均保持稳定.该细胞系已在体外培养32代(1 a以上),提示其具有永生性.结论:已成功建立永生性大鼠HSC系,该细胞系的基本特征与活化的原代HSC相似.
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SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响
目的:探讨SB431542对肝星状细胞T6(HSCT6)Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响.方法:HSC T6细胞贴壁后,在细胞培养瓶中加入SB431542 10 μmol/L培养2h,用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察细胞内Smad4蛋白细胞内转位.将HSC T6细胞分成3组:空白对照组、SB431542 1 μmol/L组、SB431542 10 μmol/L组,培养24 h后分别提取细胞浆蛋白及核蛋白,以Western blot法检测Smad4蛋白表达水平变化.结果:SB431542 10 mol/L作用2h后,未出现Smad4蛋白向细胞核内转位.HSC T6细胞贴壁后被SB431542 1 μmol/L、SB431542 10 μmol/L作用24 h后,细胞浆内Smad4蛋白表达量较空白对照组减少,呈剂量依赖型;而细胞核内Srnad4蛋白表达量较空白对照组增多.结论:SB431542通过抑制大鼠HSC活化过程中Smad4蛋白在细胞内的核转位,可起到阻断TGF-β1/Smad通路的细胞内信号转导的作用.
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白介素-1O对大鼠肝星状细胞核因子-κB、细胞因子及细胞间黏附分子-1表达的影响
目的:探讨白介素-10对大鼠肝星状细胞的干预作用和作用机制.方法:分离大鼠肝星状细胞(HSC),采用不同浓度的白介素-10处理后,分别应用ELISA法和Northern blot检测大鼠HSC中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子-α和白介素-1β蛋白和mRNA的表达,采用凝胶迁移率法检测核因子κB(NF-κB)活性.结果:白介素-10可明显下调大鼠HSCICAM-1、TNF-α及IL-1β表达,并且抑制NF-κB活性,其效应呈浓度依赖性.结论:白介素-10可能通过下调HSCICAM-1、TNF-α及IL-1β表达和抑制NF-κB活性来发挥其抗炎和抗纤维化作用的.
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微小RNA-195调控转化生长因子-β/Smad信号通路影响肝纤维化机制研究
目的 研究微小RNA-195(miR-195)调节转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)活化与Smad7表达的关系.方法 体外培养HSC-T6,用5 ng·mL-1 TGF-β1作为刺激因子,模拟大鼠肝纤维化模型.将细胞分为6组:对照组、模型组(TGF-β1组)、miR-195 mimic实验组、miR-195 mimic NC实验组、miR-195 inhibitor实验组及miR-195 inhibitor NC实验组.分别用5 ng·mL-1 TGF-β1处理HSC-T6细胞24,48,72 h后,以实时荧光定量PCR法检测miR-195、Smad7及α-SMA mRNA表达,以免疫印迹法检测Smad7蛋白表达.结果 在TGF-β1诱导下,miR-195的表达随时间逐渐升高、α-SMA表达逐步上调而Smad7表达呈降低趋势,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.01;P<0.05).与模型组比较,miR-195 mimic能促进TGF-β1诱导的HSC-T6活化,升高miR-195、α-SMA mRNA表达而降低Smad7mRNA和蛋白表达,差异均有统计学意义(均P<0.01).同时,miR-195inhibitor可逆转TGF-β1诱导的HSC-T6活化,降低miR-195、α-SMA mRNA表达而升高Smad7 mRNA和蛋白表达,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 miR-195促进TGF-β1诱导的HSC-T6活化与Smad7表达相关.
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丹参酸乙对大鼠肝星状细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的影响
目的观察丹参酸乙对大鼠肝星状细胞α-平滑肌肌动蛋白的影响.方法原位灌注、消化法分离正常大鼠肝星状细胞,异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白基因表达,免疫印迹法分析α-平滑肌肌动蛋白量.结果10μmol/L SAB可抑制肝星状细胞α-平滑肌肌动蛋白的基因表达,但不能抑制其蛋白表达.细胞经TGFβ1刺激后,不仅1μmol/L SAB甚至10μmol/L SAB均不能抑制α-平滑肌肌动蛋白的基因表达.结论丹参酸乙在肝星状细胞活化的启动阶段可延缓其活化,对于已活化的细胞丹参酸乙则无逆转作用.
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肝脏星状细胞与细胞外基质、金属蛋白酶的研究进展
80年代初,用胶原酶、链酶蛋白酶原位循环灌注法首先成功地分离了大鼠肝星状细胞(旧称储脂细胞、Ito细胞),从此人们开始了肝脏星状细胞(HSC)的体外研究.HSC是肝纤维化细胞外基质的主要来源细胞.而肝细胞的正常功能和HSC能保持静止状态,均有赖于Disse腔内正常的细胞外基质成分.本文就HSC与细胞外基质及金属蛋白酶之间的相互关系、相互作用机制作一综述.
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葛根素对大鼠肝星状细胞生长及NF-κb p65和TGF-β1表达的影响
目的 探讨葛根素对大鼠肝星状细胞生长及核转录因子κB 亚基(NF-κB)p65和转化生长因子(TGF)-β1表达的影响.方法 将培养的大鼠肝星状HSC-T6细胞随机分为溶剂组和葛根素组,葛根素组包括0.1、1.0和10.0 μmol/L 3个不同浓度组,溶剂组加入二甲基亚砜(DMSO).采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的周期分布,酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞中TGF-β1含量,Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白表达.结果 葛根素能够呈浓度-时间效应关系抑制HSC-T6细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期.TGF-β1含量和NF-κB p65蛋白的表达水平均随葛根素浓度的增加而降低.结论 葛根素能够抑制HSC-T6细胞生长,其作用机制可能与抑制炎症相关因子TGF-β1和NF-κB信号通路有关.
关键词: 大鼠肝星状细胞 葛根素 细胞增殖 转化生长因子-β1 核转录因子-κBp65 -
软肝冲剂对大鼠肝星状细胞增殖及分泌TGFβ1影响的血清药理学研究
软肝冲剂是我院30年来防治肝硬化的协定处方,已进行的实验研究证实其具有抗鸭乙型肝炎肝纤维化的作用.为进一步从细胞分子水平揭示其抗肝纤维化的机理,我们通过建立大鼠肝星状细胞(HSC)体外培养体系,用3H-TdR掺入法测定HSC的增殖,用细胞抑制MTT比色法测定总转化生长因子β1(TGFβ1)的活性来进行软肝冲剂对大鼠HSC增殖和分泌TGFβ1影响的血清药理学研究,现报告如下.
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褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞透明质酸、Ⅲ型前胶原分泌及Ⅰ型胶原mRNA表达的抑制作用
本研究在自身免疫性肝炎(AIH)大鼠模型肝星状细胞培养过程中加入褪黑素(MT),检测培养上清中透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量,并采用RT-PCR法观察MT对肝星状细胞(HSC)表达Ⅰ型胶原(colⅠ)mRNA的影响.
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高山红景天对大白鼠肝星状细胞增殖分化的影响
高山红景天是中药制剂,主要有效成分为红景天甙、甙元酪醇、蛋白质、黄酮、有机酸、酚性化合物、甾类及微量元素等.本文观察红景天水煎剂对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和Ⅰ型胶原合成的影响,研究其防治肝纤维化的作用和机制.
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丹参酮ⅡA与阿米洛利合用对大鼠肝星状细胞氧应激所致纤维化的抑制作用
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白细胞介素7对转化生长因子β1诱导的大鼠肝星状细胞的影响
肝星状细胞(HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键环节[1].转化生长因子(TGF)β1可通过HSC内的TGFβ/Smads信号通路促进纤维化的发生发展,被认为是调控肝纤维化的核心物质.抑制TGFβ1合成或其信号传导已证明能拮抗HSC活化与细胞外基质的产生,成为抗肝纤维化的主要目标[2].IL-7是在骨髓中早发现的一种细胞因子,以往研究证实其能通过上调成纤维细胞Smad7的表达抑制TGFβ/Smads信号通道,具有抗纤维化的作用[3-5].本实验旨在了解IL-7在肝纤维化中的作用,并探讨其作用的分子机制.
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血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞表达转化生长因子βⅠ、Ⅱ型受体及其功能的影响
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)除可收缩血管外,还参与调节细胞生长和多种基因表达.我们以前的研究也证实,在一定浓度范围内AngⅡ对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成具促进作用[1].肝纤维化发生中关键的事件是HSC的激活及其功能的变化.本研究观察了AngⅡ对HSC表达生长因子及其受体的影响,以及它在基因转录水平对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的调控作用,旨在初步探讨其促进HSC胶原合成的机制.
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血管紧张素Ⅱ调控大鼠肝星状细胞血管紧张素Ⅱ受体表达及其功能的影响
国内外学者在心、肾、肺等脏器纤维化实验研究中发现,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能刺激这些脏器组织间质成纤维细胞胶原分泌,证实AngⅡ参与组织纤维化的形成.现已证实AngⅡ调节血压、水电解质平衡和细胞生长都是通过AngⅡⅠ型受体(AT1R)发挥作用.在肝纤维化发生过程中,肝星状细胞(HSC)是否也表达AT1R和AT2R,为此我们观察了AngⅡ对大鼠HSC表达AngⅡ受体(ATR)及前胶原基因的调控情况,旨在探讨AngⅡ对HSC功能的影响及其机制.
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丹酚酸B对大鼠肝星状细胞增殖周期的抑制作用
丹酚酸B(SAB)是丹参的主要水溶性成分,具有良好的抗D-半乳糖胺急性肝损伤和抗四氯化碳诱导的肝纤维化作用,还可抑制肝星状细胞(HSC)增殖及胶原合成[1],对脂质过氧化有很强的抑制作用,临床上已初步显示具有一定的抗肝纤维化作用.肝纤维化发生过程中,细胞外基质的主要来源是活化的HSC.我们试图在细胞增殖的整体水平上探讨SAB抗肝纤维化的作用机制.
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扶正化瘀方对大鼠肝星状细胞旁分泌活化途径的抑制作用
肝星状细胞(HSC)活化是一复杂过程,涉及到细胞-细胞、间质-细胞间相互作用,其中旁分泌活化途径是HSC活化启动的关健因素,库普弗细胞(KC)是活化这一途径的主要细胞之一.我们观察中药扶正化瘀方(319方)对KC激活HSC这一旁分泌活化途径的干预.
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MAPK抑制因子对HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响
目的 探究3种丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)抑制因子对转化生长因子-β( TGF-β)活化的大鼠肝星状细胞( HSC)中Smad2/3磷酸化及Smad4 核转位的影响. 方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位肝灌流法分离正常大鼠HSC并传代培养,分别用细胞外信号调节激酶( ERK)、c-Jun氨基末端激酶( JNK )、p38 抑制因子( PD98059、SP600125、SB203580 )与HSC共同培养,再加入TGF-β1活化细胞,采用免疫沉淀和 Western blot 法检测 pSmad2C、pSmad2L、pS-mad3L蛋白表达;采用细胞免疫荧光法检测Smad4 蛋白表达及细胞内定位情况. 结果 Western blot显示静息状态下HSC几乎不表达 pSmad2C 而低表达 pSmad2L、pSmad3L, TGF-β1刺激后显著上调上述磷酸化蛋白表达, p38 抑制因子(1、3 μmol/L)、ERK 抑制因子(1 μmol/L)对 Smad2C、Smad2L、Smad3L 磷酸化无显著影响;p38 抑制因子( 10μmol/L)降低了 pSmad3L 蛋白表达;ERK 抑制因子( 3、10μmol/L)降低了pSmad2C蛋白表达;JNK抑制因子(1、3、10μmol/L)减少了 pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L 蛋白表达.TGF-β1刺激可明显诱导Smad4核转位,而3种MAPK抑制因子不同程度地抑制TGF-β1 诱导的Smad4 转位入核. 结论 在 HSC 细胞中 TGF-β1 可能通过活化 JNK 通路促进Smad2/3磷酸化,活化ERK、JNK、p38 通路促进Smad4 核转位.
关键词: 大鼠肝星状细胞 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 Smad2 smad3 Smad4