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鸭腔上囊胚后发育期淋巴细胞凋亡与凋亡相关蛋白的表达
目的 研究天府肉鸭腔上囊胚后发育期淋巴细胞凋亡及其Caspase-3、Bcl-2蛋白表达的动态变化规律,以探讨B淋巴细胞凋亡的调控机制.方法将胚后0～29周龄天府肉鸭分为11个组,每组5只.采用常规HE染色,原位缺口末端标记法(TUNEL)和免疫组织化学技术.结果胚后0～3周,滤泡髓质淋巴细胞凋亡指数升高,皮质淋巴细胞凋亡指数无明显变化;两者在5周下降,17周回升,随后呈上升趋势,29周达峰值.0～14周,滤泡髓质淋巴细胞凋亡指数明显高于皮质;17～29周则显著低于皮质.淋巴细胞Caspase-3表达规律与凋亡指数呈方向一致的变化关系,而Bcl-2与凋亡指数呈反向变化关系(5～14周除外).结论淋巴细胞凋亡在鸭腔上囊胚后发育过程中普遍存在,并具有明显增龄变化特征;Caspase-3、Bcl-2蛋白在淋巴细胞中表达的变化规律可能是淋巴细胞凋亡具有增龄变化特征的重要机制之一.
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创伤后应激障碍大鼠海马神经元凋亡的形态学变化及相关基因表达
目的 探讨创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元Bcl-2和Bax的表达及与神经元凋亡的关系.方法 采用国际认定的SPS方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,取SPS刺激后1d、4d、7d、14d组和正常对照组.应用透射电镜和原位末端标记法观察PTSD大鼠海马神经元细胞凋亡的形态学变化并检测细胞凋亡指数;应用免疫组织化学、免疫荧光双标、激光共焦显微镜技术和免疫印迹法检测Bel-2和Bax蛋白的表达. 结果 PTSD大鼠海马神经元出现细胞凋亡改变;凋亡细胞数量随时问的延长而逐渐增多,于SPS刺激后7d达高峰;Bel-2蛋白于SPS刺激后4d达高峰;Bax蛋白于SPS刺激后7d达高峰,之后逐渐下降.Bcl-2/Bax的比值于SPS刺激后一过性增加,以后随时间延长比值下降. 结论海马神经元细胞凋亡可能是PTSD大鼠海马萎缩的原因之一;Bel-2和Bax蛋白含量增加以及两者的比值失衡可能是导致PTSD大鼠海马神经元凋亡的原因之一.
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四氯化碳对大鼠海马CA1区神经元低亲和力神经生长因子受体p75表达的影响
目的 研究四氯化碳(CCl4)对大鼠脑海马CA1区神经元低亲和力神经生长因子受体p75的表达和凋亡的影响.方法 将24只健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组和CCl4组.对照组每周一、四背部皮下注射橄榄油(0.12ml/100g),CCl4组分别在每周一或/和周四背部皮下注射60%CCl4-橄榄油溶液(0.3ml/100g)1次(1d组)、2次(1周组)和4次(2周组),实验结束时处死大鼠.取脑后沿正中矢状面切开,右侧半脑石蜡切片,行Nissl染色,观察海马CA1区神经元的形态学改变;行p75、Bax免疫组织化学染色和Western blotting分析,检测海马CA1区神经元p75、Bax的表达,行原位缺口末端标记法(TUNEL)观察海马CA1区神经元的凋亡.结果 Nissl染色显示对照组CA1区神经元染色较深,细胞数目较多,排列整齐,神经元内可见大量尼氏体;CCl4组CA1区神经元排列较对照组紊乱,部分锥体细胞体积缩小,核固缩,呈三角形,胞浆内尼氏体数目减少或消失.对照组海马CA1区可见少量表达p75和Bax的阳性细胞;CCl4组海马CA1区表达p75和Bax的阳性细胞数较对照组明显增多,以1周CCl4组增多为明显;Western blotting结果与免疫组织化学染色结果一致.对照组海马CA1区未见TUNEL阳性细胞;CCl4组海马CA1区可见大量细胞核呈棕黄色着色的TUNEL阳性细胞,以1周CCl4组的阳性细胞数多.结论 注射CCl4后,大鼠脑海马CA1区p75的表达明显增强,Bax的表达也相应增强,凋亡的神经元明显增多.
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短暂缺氧对新生鼠脑细胞凋亡和神经再生的影响
目的 探讨短暂缺氧对新生鼠脑神经源性分化因子(NeuroD)表达以及细胞凋亡和神经再生的影响.方法 新生10～24h的SD大鼠短暂置于100%氮气环境中,建立出生窒息模型.96只新生大鼠随机分为对照组、缺氧20min组,其中1个亚组分3个时间点(13、20、27d)取材,采用免疫荧光法检测NeuroD、免疫组织化学法检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)表达的变化.另一亚组分2个时间点(6、20d)取材,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡.结果 免疫荧光/免疫组织化学结果显示,缺氧20min组13、27d NeuroD和BrdU在海马CA1区/室下区的表达量均高于对照组(P＜0.05),且在20d表达量高(P＜0.01).TUNEL法检测出缺氧20min后6d在海马CA1区凋亡细胞阳性率明显高于对照组(P＜0.01),而20d凋亡细胞阳性率与对照组比较差异无统计学意义.结论 缺氧引起迟发性细胞凋亡,导致神经元缺失,可能诱导细胞增殖、分化,触发神经发生,对受损的脑组织进行代偿性修复和神经功能重建.
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N-硝基-L-精氨酸甲酯对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡及Bax表达的影响
目的 研究N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡及凋亡相关基因Bax表达的影响.方法 手术建立大鼠单侧隐睾模型,实验分为隐睾组、隐睾+L-NAME组[术后腹腔注射溶于生理盐水的L-NAME 50 mg/(kg·d)]、隐睾+生理盐水组、假手术组,7 d后采用化学比色法检测睾丸组织NOS活性,流式细胞术(FCM)和原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡,RT-PCR和免疫组织化学法检测Bax基因表达变化.结果 隐睾组和隐睾+生理盐水组之间检测指标无明显差异;隐睾+L-NAME组隐睾凋亡细胞百分比和生精细胞凋亡指数均低于隐睾组及隐睾+生理盐水组,高于假手术组(P＜0.05);Bax mRNA和蛋白表达水平隐睾组及隐睾+生理盐水组高,假手术组次之,隐睾+L-NAME组低.结论 隐睾生精细胞Bax表达增加,L-NAME可通过下调Bax的表达抑制隐睾生精细胞凋亡.
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生长抑素对肝星状细胞的影响机制
目的:研究生长抑素(somatostatin,SST)与大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增生、凋亡的关系.方法:分离、培养的原代大鼠HSC,经不同浓度SST(10-6-10-10mol/L)处理72 h后,以吖啶橙(acridineorange,AO)/溴乙啶(ethidium bromide,EB)荧光染色法、末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、透射电镜及流式细胞术检测其凋亡率的改变.SST作用120 h后,以甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测HSC增生率的变化.并通过对细胞动力学的观察,探讨SST的作用机制.结果:SST可通过剂量依赖方式抑制HSC增生,提高HSC凋亡率.浓度为10-6mo1/L或10-7mol/L时效果尤为显著.Go/G1期阻滞是SST发挥作用的重要途径.结论:低剂量SST即可抑制HSC增生,并促进其凋亡,提示SST在抗肝纤维化方面具有潜在价值.
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P53和Bcl-2家族蛋白在胰腺癌中的表达
目的:探讨胰腺癌组织(pancreatic carcinoma,PC)中P53和Bcl-2家族(Bcl-2,Bax,Bcl-xL,BclxS)蛋白表达及与细胞凋亡的关系.方法:免疫组化法检测35例PC中P53蛋白表达,将PC分为P53阴性表达组(第1组,n = 18)和P53阳性表达组(第2组,n = 17);Western blot检测两组PC中P53,Bcl-2,Bax,Bcl-xL和BclxS蛋白表达,TUNEL法检测第1组中凋亡指数(AI).结果:Bcl-2蛋白在P53阳性PC表达上调,而在P53阴性PC表达下调( P = 0.047);Bax和Bcl-xL蛋白在两组PC中表达都明显上调( P = 0.274,0.334);Bcl-xS在P53阳性表达PC明显下调,在P53阴性表达组明显上调( P = 0.01);在P53阴性和阳性表达PC,AI分别为12.1±2.47和9.1±1.48( P = 0.023);Bcl-2家族各成员表达与AI无相关性,而Bcl-2/Bax比率与AI有明显的相关性( P<0.01).结论:Bcl-2是依赖P53调节的抗凋亡蛋白,BclxS是依赖P53调节的促凋亡蛋白,而P53主要通过调节Bcl-2/Bax比率发挥凋亡调节作用.
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大鼠创伤性脑损伤后iNOS表达与神经元凋亡
一、材料与方法健康SD大鼠共52只.随机分为(1)假手术组,仅去除骨瓣开骨窗而不打击;(2)创伤性脑损伤(traumatic braininjury,TBI)组;(3)生理盐水组;(4)氨基胍(aminoguanide,AG)组.生理盐水组、AG组于伤后6h分别腹腔注射生理盐水、AG(100mg/kg),每隔24h注射,连续注射3次;(5)空白对照组.TBI采用改进的Feeney法大鼠脑损伤模型,致伤力度为550g/cm.预设伤后24h、72h、168h 3个时相点,在各预设时点灌注取脑作相应检测:尼氏染色病理学观察;诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)免疫组化检测;凋亡细胞原位缺口末端标记法(TdT mediateddUDP nick endlabeling,TUNEL)观察细胞凋亡情况.
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超低频脉冲梯度磁场诱导癌细胞凋亡
首次观测到磁场诱导鼠癌细胞凋亡的形式特征,.凋亡的癌细胞收缩变圆,与周围细胞脱离;异染色质浓缩,沿核膜内侧排列,凝结成块;内质网池状水肿并与细胞膜融合;细胞膜和核膜上出现空洞,膜内外在交换物质;出现许多被膜包裹的凋亡小体;凋亡小体被一些淋巴细胞,浆细胞吞噬.用原位缺口末端标记法(TUNEL)测定癌细胞凋亡,发现磁场治疗组的凋亡细胞的数目明显大于对照组的凋亡癌细胞的数目.
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额叶锐器损伤幼鼠神经细胞凋亡及Bax与Bcl-2蛋白的表达变化
目的 探讨额叶锐器损伤后幼鼠神经细胞凋亡的变化规律及调控机制.方法 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)进行细胞凋亡检测,观察伤后幼鼠细胞凋亡变化;采用免疫组织化学染色方法观察其创伤区及周边的Bax及Bcl-2阳性细胞的表达变化.结果 脑损伤1 h后幼鼠创伤区及周边皮质即发现凋亡细胞,随伤程的推移,TUNEL阳性凋亡细胞数量逐渐增多,24 h达到高峰,之后凋亡细胞数量逐渐下降,120 h偶见少许凋亡细胞.创伤后1 h幼鼠Bax阳性细胞的表达开始增高,12 h达到高峰,之后逐渐下降,脑损伤后120 h仅有少量表达.在伤后1 h幼鼠Bcl-2的上调明显,Bcl-2阳性凋亡细胞数目达到高峰,随后Bcl-2的表达下调逐渐下降.脑损伤后120 h仍见少部分表达.空白对照组及假手术组幼鼠额叶皮质中偶见Bax和Bcl-2阳性细胞表达;伤后Bax/Bcl-2比值上调,24 h达到高峰,随后逐渐下降.结论 幼鼠额叶锐器伤后存在细胞凋亡,凋亡细胞数量的变化与损伤后时程有关,Bax/Bcl-2比值是决定幼鼠细胞凋亡的重要因素.
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过氧化物酶体增殖因子活化受体δ基因对人大肠癌细胞凋亡的影响
过氧化物酶体增殖因子活化受体δ(PPAR8)是APC/β-catenin/Tcf-4信号通路上亟待揭示的下游靶基因之一,其下游靶基因的激活可能导致大肠癌的发生.本实验采用流式细胞术及原位缺口末端标记法(TUNEL)观察PPAR8基因沉默对大肠癌细胞凋亡的影响.
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冰冻和石蜡切片对TUNEL染色结果的影响
目的与方法:为比较不同组织切片方法对细胞凋亡TUNEL反应结果的影响,用雏鸭胸腺分别制成冰冻(8 μm)和石蜡(6 μm)切片,然后进行TUNEL染色. 结果: 冰冻切片组细胞凋亡阳性率高,背景清晰,特异性好.石蜡切片组则阳性率相对较低,反差较小,容易出现假阳性. 结论: 不同制片法对TUNEL结果有影响,即冰冻切片可能较石蜡切片具有更高的反应敏感性.
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TUNEL检测心肌细胞凋亡的影响因素探讨
目的:探讨避免TUNEL法检测心肌细胞凋亡出现的假阳性和消除非特异性反应的方法以及选择合适的蛋白酶K浓度.方法:4%多聚甲醛固定心肌组织,制作石蜡切片.①将试剂盒说明常规步骤加以改良,将0.3%H2O2放在反应液标记DNA片段之后,先后用小牛血清或羊血清两次封闭非特异性反应;②按蛋白酶K不同剂量分为10、20 μg/mL蛋白酶K和不加蛋白酶K组(均n＝5),再按照改良的TUNEL法检测心肌细胞凋亡.结果:①改良TUNEL法,避免了假阳性,背景清晰;②未加蛋白酶K组较10或20 μg/mL蛋白酶K组心肌细胞凋亡率显著减少(均P<0.05),两组蛋白酶K组心肌细胞凋亡率差异未见有统计学意义(P＞0.05).结论:①改良后的TUNEL方法适用于心肌细胞凋亡的检测;②TUNEL法检测心肌细胞凋亡选择10、20 μg/mL蛋白酶K是适当的.
