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永生大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定
目的:建立永生性大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)系.方法:采用改良胶原酶原位灌注法消化肝脏,经Nycodenz密度梯度离心分离、鉴定成年Sprague-Dawley大鼠的HSC.然后通过细胞克隆建立HSC系(HSC-PQ)并传代培养.结合细胞动力学、光镜、透射电镜及免疫细胞化学技术检测HSC-PQ系的倍增时间、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白表达、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成等表型特征.结果:分离获得的HSC约为2X107细胞/只大鼠,细胞成活率>95%,纯度>90%,培养2 wk后几乎所有HSC均已活化.在此基础上经细胞克隆所得的HSC-PQ系表型类似成纤维细胞,倍增时间约75 h,可表达结蛋白、α-SMA以及除Ⅳ型胶原外的多种ECM成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等),且传代过程中增生、ECM表达等特性均保持稳定.该细胞系已在体外培养32代(1 a以上),提示其具有永生性.结论:已成功建立永生性大鼠HSC系,该细胞系的基本特征与活化的原代HSC相似.
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支气管肺泡灌洗操作体会
支气管肺泡灌洗(BAL)的方法学目前不完全统一。我们参照欧洲常用方法进行操作[1,2],获得了理想的支气管肺泡灌洗液(BALF)标本。 对象与方法 9例双肺弥漫性病变和3例双侧肺门淋巴结肿大患者。11例于右中叶、1例于左舌叶进行BAL。纤维支气管镜(纤支镜),型号为Olympus BF 1T30。按纤支镜检查常规[3]进行术前准备和麻醉。先吸去管腔内液体,随后将纤支镜尖端嵌入3~4级支气管,保持密封和稳定。取下纤支镜负压吸引装置和活检孔上的橡皮套,将负吸孔阻塞密封,用60 ml注射器直接连接在活检孔上缓慢注入37 ℃生理盐水50 ml后立即手工柔和回抽。依次注入及回抽4筒共计200 ml生理盐水。回收BALF置入硅酮管中送检。BAL结束后吸去管腔内残余液体。 结果 除1例因注入100 ml生理盐水后回收<20 ml而终止灌洗外,其余11例BALF回收率高达73%(145 ml)、低为50%(100 ml),平均58%(115 ml)。BALF中细胞总数10~25×106,细胞成活率>90%,细胞分类以肺泡巨噬细胞和淋巴细胞为主。 讨论 以往BAL技术规范[4]中采用负压吸引(25~100 mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa)回收灌洗液,负压不易调节,常造成支气管粘膜损伤出血或管腔陷闭,影响BALF回收数量和质量。故推荐本方法进行BAL操作。
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多巴胺代谢引起氧化应激导致鱼藤酮诱导的PC12细胞毒性作用
鱼藤酮是一种常见的杀虫剂,也是线粒体呼吸链复合体Ⅰ的特异性抑制剂,大鼠长期喂鱼藤酮可以引起类似帕金森病(PD)的生化和组织水平的改变,如黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丧失等等.该文用PC12细胞系从氧化应激的角度论证多巴胺在此细胞毒性过程中的作用.实验结果表明,加鱼藤酮组的细胞成活率有明显降低而且胞内多巴胺浓度显著升高并与加药脸始亮恳览倒叵?鱼藤酮也影响PC12细胞中与多巴胺合成和转运相关的蛋白质和酶活性的改变.在这些细胞中,单胺转运蛋白2(VMAT2)活性显著下调,多巴胺转运蛋白(DAT)活性上调,单胺氧化酶(MAO)活性增强.
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31 ℃普通恒温箱和小牛血清保存活性角膜组织的实验研究
目前研究出一种操作简单且方便实用的保证角膜内皮细胞成活率(Endothelial Survival Bate,ESR)较高的方法,同时能解决保存中的污染问题和选择佳小牛血清浓度,用此方法,使眼库系统易于普及和推广.
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微波灭活后的国人成骨肉瘤细胞(OS-732)的超微结构变化
随着针对骨肉瘤基础研究的深入和保肢手术治疗的开展,有效灭活骨肉瘤组织成为手术当中为关键的一环,它直接关系到术后复发、远处转移以及生存率的问题.我们采用微波灭活成骨肉瘤细胞(OS-732),观察灭活后细胞形态和超微结构改变及细胞成活率,为临床应用提供基础研究依据.
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血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响
目的 探讨血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响.方法 将人脐带间充质干细胞分别培养在不含血清、含灭活血清和含未灭活血清的低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(L-DMEM)中.每天用显微镜观察脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长情况,并计算细胞总数、统计细胞成活率.结果 脐带间充质干细胞在含未灭活血清的L-DMEM中生长状况好,在不含血清的L-DMEM中生长状况差.结论 含未灭活血清的L-DMEM是脐带间充质干细胞体外培养的佳培养基.
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影响人胚胎脑组织冷藏因素的研究
人胎脑组织的良好保存是临床上中枢神经系统疾病或损伤的患者获得脑组织移植的根本保证.本人从事神经细胞冷藏技术多年,曾对人胎脑神经细胞的冷藏保存进行了系列研究.我们对人胎脑组织在4℃冰箱和-196℃液氮内保存、脑组织块与脑细胞悬液冷藏和人胎脑组织与大鼠胎脑组织冷藏后的活细胞成活率进行了比较,并对冷藏时合理控制温度下降速度进行了探索.收集2hr内水囊引产8~16W的人胚胎,在无菌条件下取大脑皮质或黑质,入不含钙镁的PBS中.将脑组织剪碎(脑组织块冷藏组被剪成2mm3小组织直接入MEM培养液)过200目尼龙网制成悬液,离心去上清后加入EME培养液并分装数管.取一管进行台盼蓝染色做细胞总数计数、活细胞及死亡细胞计数,为冷藏前对照.其余分别放入4℃冰箱保存和-196℃液氮内保存(先4℃ 10min,再入-20℃ 10min,然后再投入液氮中).这样可以合理的控制温度的下降速度,从而减少快速冷冻对细胞的损伤.结果表明,4℃冰箱保存组1~5d的细胞成活率明显高于液氮保存组.但5d后4℃冰箱保存组的细胞逐渐死亡,而液氮保存组细胞成活率并不随保存时间的延长而明显改变.因此 ,需要长期保存的脑组织以液氮冷藏为宜,而短期内将用于科研和临床的脑组织好采用4 ℃冰箱保存.我们在实验中发现,以脑组织块的形式放入培养液进行液氮冷藏,复苏后制成悬液在镜下观察,其细胞成活率高于悬液保存组,且细胞形态与冷冻前接近.其机制有待进一步探讨.冷藏前我们还对加有10%的二甲基亚砜的细胞悬液与未加组的细胞悬液进行了观察比较, 发现前者的细胞成活率略低于后者.我们认为二甲基亚砜对细胞可能有一定的毒性作用.我们还发现在同样条件下,大鼠脑组织冷藏后的细胞成活率高于人的脑组织细胞成活率.说明人的脑组织冷藏要求条件高、难度大.我们采用所掌握的冷藏技术已成功地将人胚胎黑质细胞移植到了大鼠帕金森氏病动物模型的脑中,并获得了预期的结果.